Phospho-Rad17 (Ser645) Antibody [D14D16]
目录号: F6403
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: Hela, Lane 2: Hela (CIP and λ phosphatase treated)
使用信息
| 稀释比例 |
|---|
|
| 抗体应用 |
|---|
| WB, IP |
| 反应性 |
|---|
| Human |
| 抗体类型 |
|---|
| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
|---|
| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
|---|
| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
|
预测分子量
|
|---|
|
80 kDa
|
| 阳性对照 | HeLa cells; MRC-5 cells (UV, 100 mJ/cm2, 2 h) |
|---|---|
| 阴性对照 |
实验方法
| WB |
|---|
实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
|
生物描述
| 特异性 |
|---|
| Phospho-Rad17 (Ser645) Antibody [D14D16] 仅识别 Ser645 处磷酸化的内源性 Rad17 蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
|---|
| 染色体，细胞核 |
| Uniprot ID |
|---|
| O75943 |
| 克隆号 |
|---|
| D14D16 |
| 别名 |
|---|
| Cell cycle checkpoint protein RAD17; RAD17 |
| 背景 |
|---|
| Ser645位点的磷酸化Rad17代表了RFC样钳状加载蛋白家族中Rad17检查点蛋白的激活形式，该蛋白对于感知DNA损伤和复制压力以维持细胞周期阻滞至关重要。该蛋白保持着类似于复制因子C的环状结构，具有独特的AAA+ ATPase结构域，这些结构域促进其与Rad9-Rad1-Hus1 (9-1-1)滑动钳的相互作用，并通过ATRIP-RPA识别被募集到ssDNA-dsDNA连接处的染色质上。当受到电离辐射或复制抑制剂等基因毒性损伤时，ATR激酶通过两步过程靶向Ser645位点的SQ基序进行磷酸化：预先结合的Rad17捕获9-1-1复合物，从而增强局部ATR活性，并引发磷酸化Ser645依赖的构象变化，进而稳定钳状加载并传递下游信号。这种修饰使Rad17能够作为支架蛋白，在双链断裂处组装MRN复合物（MRE11-RAD50-NBS1），引导ATM/ATR激活，进而引发CHK1/CHK2磷酸化级联反应，最终通过Cdc25失活阻断S期进程和G2/M期转换。在未受干扰的复制过程中，磷酸化Ser645的峰值出现在G1期晚期至G2/M期，但在损伤条件下，其在G1期早期迅速升高，这反映了细胞周期调控的基础启动与可诱导的ATR/ATM反应叠加。Ser645和Ser635同时突变为丙氨酸会消除G1/S期和G2期检查点的执行，使细胞对致断裂剂和复制毒素高度敏感。ATM缺陷型细胞中Ser645的磷酸化水平虽不理想，但仍能维持，这凸显了ATR在此过程中的主导作用。 |
| 参考文献 |
|---|
|
技术支持
在订购、运输、储存和使用我们的产品的任何阶段，您遇到的任何问题，均可以通过拨打我们的热线电话400-668-6834，或者技术支持邮箱tech@selleck.cn，直接联系到我们。我们会在24小时内尽快联系您。
* 必填项
