Phospho-RelB (Ser552) Antibody (Rabbit mAb) [C17L2]
目录号: F8755
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: Raji, Lane 2: Raji (TPA, 100 ng/ml, 30min)
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB, IP, IF, FCM |
| 反应性 |
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| Human, Mouse |
| 抗体类型 |
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| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
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62 kDa
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| 阳性对照 | Raji cells (TPA, 200 nM, 30 min); A20 cells (TPA, 200 nM, 30 min); CTTL2 cells (TPA, 200 nM, 30 min) |
|---|---|
| 阴性对照 | Raji cells |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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| IF |
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实验步骤：
样品准备
1. 贴壁细胞：取洁净无菌盖玻片置于培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片。
2. 悬浮细胞：将细胞接种至多聚赖氨酸包被的洁净无菌载玻片上。
3. 冰冻切片：将玻片置于室温下解冻，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。
4. 石蜡切片：先将玻片脱蜡至水，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。然后进行抗原修复。
固定
1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室温固定细胞爬片/涂片或组织切片 10~15 min。
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
通透
1. 对样品添加去垢剂，如 0.1~0.3% Triton X-100，室温通透 10~20 min。
（仅针对胞内抗原，若是细胞膜上表达的抗原则可省略该步骤。）
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
封闭
添加封闭液，在室温下封闭至少 1 h。（常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或山羊血清。）
注意事项：从封闭开始之后的所有步骤务必保证样品湿润，避免干燥，否则极易产生高背景。
免疫荧光染色（第一天）
1. 吸走封闭液，滴加稀释后的一抗。
2. 湿盒中 4°C 孵育过夜。
免疫荧光染色（第二天）
1. 吸走一抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
2. 滴加稀释后的荧光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。
3. 吸走二抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
4. 滴加稀释后的 DAPI，室温避光 孵育 5~10 min。
5. PBST 中摇洗 3 次，每次 5 分钟。
封片
1. 抗荧光淬灭封片剂封片。
2. 干燥玻片，将玻片置于室温下避光过夜。
3. 将载玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。
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生物描述
| 特异性 |
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| Phospho-RelB (Ser552) Antibody (Rabbit mAb) [C17L2] 仅识别 Ser552 处磷酸化的内源性 RelB 蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
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| 细胞质，细胞骨架，细胞核 |
| Uniprot ID |
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| Q01201 |
| 克隆号 |
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| C17L2 |
| 别名 |
|---|
| I-Rel | IMD53 | IREL | REL-B | RELB | RELB proto-oncogene | NF-kB subunit | Transcription factor RelB | v-rel avian reticuloendotheliosis viral oncogene homolog B (nuclear factor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cells 3) | v-rel reticuloendotheliosis viral oncogene homolog B | v-rel reticuloendotheliosis viral oncogene homolog B | nuclear factor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cells 3 |
| 背景 |
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| RelB 是 NF-κB/Rel 转录因子家族的成员，它包含一个 N 端 Rel 同源结构域，支持 DNA 结合、与 p50 或 p52 二聚化和核定位，以及一个独特的 N 端亮氨酸拉链和延伸的转录激活区，这些结构域赋予 RelB 在淋巴发育、树突状细胞生物学和非经典 NF-κB 信号传导中独特的作用，并且 RelB 在 Ser552 处的磷酸化定义了一种翻译后修饰状态，该状态控制其稳定性和转录输出。该蛋白在细胞质中以非活性状态与 NF-κB2 的前体 p100 形成复合物，作为 RelB 抑制剂，隔离 RelB，直到激活非经典 NF-κB 通路的信号（例如 BAFF-R 或 CD40 的结合）诱导 NIK 和 IKKα 依赖性磷酸化以及 p100 的部分蛋白酶体加工，生成 p52，从而使 RelB-p52 异二聚体得以积累并易位至染色质，在那里它们调节参与次级淋巴器官形成、树突状细胞成熟和免疫调节细胞因子产生的基因。RelB 还受到不同于 IκB 调控的信号诱导周转：T 细胞受体或 TPA/离子霉素刺激导致 RelB 在 Thr84 和 Ser552 位点快速磷酸化，随后发生 N 端切割和完全蛋白酶体降解；将Thr84和Ser552突变为非磷酸化受体残基可消除这种磷酸化并稳定RelB，这表明Ser552位点的特异性磷酸化是RelB蛋白水解的必要前提，并且是激活后重置NF-κB依赖性基因表达程序的一种机制。糖原合成酶激酶-3β (GSK3β) 直接介导RelB在Ser552（人类编号为Ser573）位点的磷酸化，并与RelB形成复合物。抑制GSK3β可阻断Ser552的磷酸化和RelB的降解，这表明GSK3β-Ser552是连接更广泛的代谢和应激信号通路与NF-κB亚基组成以及RelB依赖性转录持续时间的关键轴。相反，RelB在Ser368位点的磷酸化使其能够与p100结合并被p100稳定，这表明RelB上不同的磷酸化位点对其与抑制因子、染色质和蛋白酶体的相互作用具有不同的调控作用，而Ser552位点的磷酸化则特异性地引导RelB脱离p100稳定的复合物池，最终降解。RelB通常以异二聚体的形式与p50或p52结合DNA，RelB/p50或RelB/p52复合物与κB位点的结合亲和力与经典的NF-κB相当，但它们既可以激活常染色质，也可以在特定的启动子处诱导异染色质的形成，这使得RelB具有转录激活因子和抑制因子的双重作用，而这种作用取决于其翻译后修饰状态，包括Ser552位点的磷酸化。在免疫和炎症环境中，RelB 在内毒素耐受期间抑制即刻反应促炎基因的表达，并限制过度的 NF-κB 活性。包括 Ser552 磷酸化在内的翻译后修饰通过影响 RelB 在染色质上的停留时间和其在特定位点维持抑制性异染色质的能力来调节这些功能。RelB 及其磷酸化的失调与 B 细胞淋巴瘤的发生和慢性炎症密切相关：RelB 促进具有组成型激活 CD40 信号的 B 细胞的存活、迁移和淋巴瘤发生；通过 Ser552 磷酸化和 GSK3β 活性改变的 RelB 周转调控会影响经典和非经典 NF-κB 输出之间的平衡，从而促进恶性 B 细胞的增殖和组织侵袭。 |
| 参考文献 |
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