Phospho-RIP3 (Ser232) Antibody [E19K17]

目录号: F1682

抗体应用：反应性：Mouse

Lane 1: L-929, Lane 2: L-929 (phosphatase-treated)

规格	价格	库存
20uL	790	现货
50uL	1240	现货
100uL	1990	现货
100uL*2	3790	现货
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使用信息

稀释比例
WB1:1000

抗体应用
WB, ELISA

反应性
Mouse

抗体类型
Rabbit Monoclonal Antibody

储存液配方
PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件(自收到货起)
-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

预测分子量
53 kDa

阳性对照	L-929 cell (treated with 20 ng/ml TNF-a, 100 nM Smac mimetic and 20 µM z-VAD for 6-8 hours), TSE cell (treated with 20 ng/ml TNF alpha,100 nM Smac mimetic, and 20 µM z-VAD for 12 h)
阴性对照

实验方法

WB
实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 120 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

Datasheet & SDS

生物描述

特异性
Phospho-RIP3 (Ser232) Antibody [E19K17] 仅识别 Ser232 处磷酸化的内源性 RIP3 总蛋白水平。

蛋白定位
细胞质，细胞核

Uniprot ID
Q9QZL0

克隆号
E19K17

别名
Rip3, Ripk3, Receptor-interacting serine/threonine-protein kinase 3, RIP-like protein kinase 3, Receptor-interacting protein 3, RIP-3, mRIP3

背景
受体相互作用蛋白 (RIP) 丝氨酸/苏氨酸激酶家族（包括 RIP1、RIP2、RIP3 和 RIP4）在调节细胞应激反应中发挥关键作用。这些激酶主要通过激活 NF-κB 启动促生存和炎症信号，并参与促进细胞死亡途径，例如凋亡。其中，受体相互作用蛋白激酶 3（RIPK3 或 RIP3）是坏死性凋亡（一种受调控的细胞坏死性死亡形式）的核心参与者。RIP3 参与由肿瘤坏死因子 (TNF) 启动的信号级联，并与 RIP1 和 TNF 受体复合物结合，介导 NF-κB 激活和凋亡。坏死性凋亡中的一个关键事件是 RIP1 和 RIP3 之间的相互作用，这种相互作用构成了坏死体（一种促进程序性坏死的多蛋白复合物）的基础。这种类似坏死性的细胞死亡通常由 TNF 信号在 caspase 抑制的情况下触发。在人类中，RIP3 丝氨酸 227 位点的磷酸化对于其与混合谱系激酶结构域样蛋白 (MLKL) 的结合至关重要，从而实现坏死体组装。在小鼠中，TNF 刺激会诱导 RIP3 苏氨酸 231 和丝氨酸 232 位点的磷酸化，这对于其与小鼠 MLKL 的相互作用至关重要。值得注意的是，小鼠 RIP3 中的丝氨酸 232 位点与人类 RIP3 中的丝氨酸 227 位点相对应。此外，RIP1 和 RIP3 还参与坏死体寡聚化，从而促进淀粉样蛋白样信号结构的形成，而淀粉样蛋白样信号结构对于执行坏死性凋亡至关重要。

背景

受体相互作用蛋白 (RIP) 丝氨酸/苏氨酸激酶家族（包括 RIP1、RIP2、RIP3 和 RIP4）在调节细胞应激反应中发挥关键作用。这些激酶主要通过激活 NF-κB 启动促生存和炎症信号，并参与促进细胞死亡途径，例如凋亡。其中，受体相互作用蛋白激酶 3（RIPK3 或 RIP3）是坏死性凋亡（一种受调控的细胞坏死性死亡形式）的核心参与者。RIP3 参与由肿瘤坏死因子 (TNF) 启动的信号级联，并与 RIP1 和 TNF 受体复合物结合，介导 NF-κB 激活和凋亡。坏死性凋亡中的一个关键事件是 RIP1 和 RIP3 之间的相互作用，这种相互作用构成了坏死体（一种促进程序性坏死的多蛋白复合物）的基础。这种类似坏死性的细胞死亡通常由 TNF 信号在 caspase 抑制的情况下触发。在人类中，RIP3 丝氨酸 227 位点的磷酸化对于其与混合谱系激酶结构域样蛋白 (MLKL) 的结合至关重要，从而实现坏死体组装。在小鼠中，TNF 刺激会诱导 RIP3 苏氨酸 231 和丝氨酸 232 位点的磷酸化，这对于其与小鼠 MLKL 的相互作用至关重要。值得注意的是，小鼠 RIP3 中的丝氨酸 232 位点与人类 RIP3 中的丝氨酸 227 位点相对应。此外，RIP1 和 RIP3 还参与坏死体寡聚化，从而促进淀粉样蛋白样信号结构的形成，而淀粉样蛋白样信号结构对于执行坏死性凋亡至关重要。

参考文献
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/25858093/ https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/23612963/

PVDF膜孔径规格选择参照表

Protein Size (kDa)	PVDF Transfer Membrane Pore Size (μm)
< 10	0.22
10-20	0.22
20-30	0.45
30-45	0.45
45-70	0.45
80-100	0.45
100-140	0.45
> 140	0.45

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* 必填项

Protein Size (kDa)	Separating Gel Percentage
4-40	20%
12-45	15%
10-70	12.5%
15-100	10%
25-100	8%
60-210	5%