Phospho-RPA32/RPA2 (Ser33) Antibody (Rabbit mAb) [H16F6]
目录号: F5040
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: Hela, Lane 2: Hela (Camptothecin, 1 μM, 1 h)
操作要点
WB
湿转参考条件：200 mA, 60 min。
建议曝光 120s 以上。
湿转参考条件：200 mA, 60 min。
建议曝光 120s 以上。
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB |
| 反应性 |
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| Human, Mouse, Rat |
| 抗体类型 |
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| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
|---|
| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
实际分子量
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29 kDa
32 kDa
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| *为什么预测分子量和实际分子量会有不同？ 以下原因可能会导致蛋白分子量与预测不同：翻译后修饰（磷酸化/糖基化）；剪接变体和异构体；相对电荷；多聚体。 |
| 阳性对照 | 293T cells (Camptothecin， 1 μM, 1 h); HeLa cells (Camptothecin， 1 μM, 1 h); NIH/3T3 cells (Camptothecin， 1 μM, 1 h); MTLn3 cells (Camptothecin， 1 μM, 1 h) |
|---|---|
| 阴性对照 | NIH/3T3 cells |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 60 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。 (建议曝光时长 120s 以上)
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生物描述
| 特异性 |
|---|
| Phospho-RPA32/RPA2 (Ser33) Antibody (Rabbit mAb) [H16F6] 仅识别 Ser33 处磷酸化的内源性 RPA32/RPA2 蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
|---|
| 细胞核 |
| Uniprot ID |
|---|
| P15927 |
| 克隆号 |
|---|
| H16F6 |
| 别名 |
|---|
| REPA2; Replication factor A protein 2; RF-A protein 2; RFA2; RP-A p32; RP-A p34; RPA2; RPA32; RPA34 |
| 背景 |
|---|
| 磷酸化RPA32/RPA2 (Ser33) 代表异源三聚体复制蛋白A (RPA) 复合物中32 kDa亚基的检查点激活形式。RPA复合物结合并稳定单链DNA中间体，并通过与DNA以及广泛的修复和检查点蛋白网络相互作用，协调DNA复制、重组和多种DNA修复途径。RPA由RPA1 (70 kDa)、RPA2 (RPA32) 和RPA3 (14 kDa) 组成，其中RPA1具有主要的高亲和力单链DNA结合活性，而RPA32的N端区域富含酸性残基，并含有多个丝氨酸和苏氨酸磷酸化位点，包括Ser33，这些位点作为调控元件，控制蛋白质-蛋白质相互作用以及在受损染色质上的动态重分布。 Ser33 位于该 N 端调控域内，是复制压力和 DNA 损伤期间 PI3K 样激酶 ATR 的直接靶标，其磷酸化发生在损伤反应早期，先于或伴随 ATR、ATM 和 DNA-PK 催化的 RPA32 在 Ser4、Ser8 和 Thr21 的额外磷酸化事件，这些事件共同在停滞的复制叉和 DNA 损伤处产生过度磷酸化的 RPA32 物种。 Ser33位点的磷酸化促进RPA在受损染色质上的积累和离散核内聚集灶的形成，增强ATRIP和ATR激酶通过损伤诱导的K63连接的泛素化途径（以PRP19-CDC5L和RFWD3 E3连接酶为中心）的募集，并促进RAD51和其他修复介质在复制应激位点的后续组装，从而将RPA包裹的单链DNA与ATR检查点激活和同源重组修复偶联起来。Ser33位点磷酸化的RPA32与RPA形成的复合物保持其核心的单链DNA结合功能，但与RAD51、RAD52、XPA、XPG、SMARCAL1和错配修复蛋白等伙伴的亲和力和相互作用谱发生改变，这些改变在复制应激反应期间调节复制叉稳定、重新启动、模板转换和重组介导的重启等途径的选择。 RPA32 的磷酸化受细胞周期调控，在 S 期，细胞周期蛋白依赖性激酶 (CDK) 对 Ser23 和 Ser29 位点进行基础修饰，作为启动事件，使得 DNA 损伤后 Ser33 和 N 端发生过度磷酸化，从而建立了一个将复制状态与 DNA 损伤信号传导能力联系起来的多层控制系统。Ser33 磷酸化的 RPA32 通过支持持续的 ATR 信号传导、CHK1 激活以及在双链断裂或持续存在的复制中间体存在时维持 G2 期阻滞，参与 ATR 依赖的 G2/M 期检查点控制。该磷酸化轴的扰乱会损害检查点的稳健性和基因组稳定性。 |
| 参考文献 |
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