Phospho-RPA32/RPA2 (Ser8) Antibody (Rabbit mAb) [B9B12]
目录号: F8601
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: HeLa, Lane 2: HeLa (UV 2 h), Lane 3: 293, Lane 4: 293 (UV 2 h)
操作要点
WB
湿转参考条件：200 mA, 60 min。
湿转参考条件：200 mA, 60 min。
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB, IF, FCM |
| 反应性 |
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| Human |
| 抗体类型 |
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| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
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29 kDa
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| 阳性对照 | 293T cells (UV, 100 mJ/cm2, 4 h recovery); HeLa cells (UV, 100 mJ/cm2, 2 h recovery) |
|---|---|
| 阴性对照 | 293T cells; HeLa cells |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 60 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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| IF |
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实验步骤：
样品准备
1. 贴壁细胞：取洁净无菌盖玻片置于培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片。
2. 悬浮细胞：将细胞接种至多聚赖氨酸包被的洁净无菌载玻片上。
3. 冰冻切片：将玻片置于室温下解冻，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。
4. 石蜡切片：先将玻片脱蜡至水，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。然后进行抗原修复。
固定
1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室温固定细胞爬片/涂片或组织切片 10~15 min。
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
通透
1. 对样品添加去垢剂，如 0.1~0.3% Triton X-100，室温通透 10~20 min。
（仅针对胞内抗原，若是细胞膜上表达的抗原则可省略该步骤。）
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
封闭
添加封闭液，在室温下封闭至少 1 h。（常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或山羊血清。）
注意事项：从封闭开始之后的所有步骤务必保证样品湿润，避免干燥，否则极易产生高背景。
免疫荧光染色（第一天）
1. 吸走封闭液，滴加稀释后的一抗。
2. 湿盒中 4°C 孵育过夜。
免疫荧光染色（第二天）
1. 吸走一抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
2. 滴加稀释后的荧光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。
3. 吸走二抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
4. 滴加稀释后的 DAPI，室温避光 孵育 5~10 min。
5. PBST 中摇洗 3 次，每次 5 分钟。
封片
1. 抗荧光淬灭封片剂封片。
2. 干燥玻片，将玻片置于室温下避光过夜。
3. 将载玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
| Phospho-RPA32/RPA2 (Ser8) Antibody (Rabbit mAb) [B9B12] 仅识别 Ser8 处磷酸化的内源性 RPA32/RPA2 蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
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| 细胞核 |
| Uniprot ID |
|---|
| P15927 |
| 克隆号 |
|---|
| B9B12 |
| 别名 |
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| REPA2; Replication factor A protein 2; replication protein A2; replication protein A2, 32kDa; RF-A protein 2; RFA2; RP-A p32; RP-A p34; RPA2; RPA32; RPA34 |
| 背景 |
|---|
| 磷酸化RPA32/RPA2 (Ser8) 指的是异源三聚体RPA复合物中复制蛋白A的32 kDa亚基的DNA损伤诱导修饰。RPA复合物是复制、重组、检查点信号传导以及所有主要DNA修复通路所必需的核心单链DNA结合因子。RPA32的N端含有多个丝氨酸和苏氨酸位点，形成磷酸化密码；在细胞周期蛋白依赖性激酶先前对Ser23和Ser29进行磷酸化的基础上，Ser4和Ser8以及Ser33和其他残基在复制压力和基因毒性损伤的刺激下，被包括DNA-PK、ATR和ATM在内的磷脂酰肌醇3-激酶相关激酶过度磷酸化。当RPA在停滞的复制叉处单链DNA上积累时，DNA-PK会磷酸化Ser4/Ser8，并作为早期复制应激信号，改变RPA-DNA和RPA-蛋白质的相互作用；缺乏DNA-PK活性或表达Ser4/Ser8无法磷酸化的RPA32突变体的细胞表现出复制检查点阻滞缺陷、停滞复制叉过早重启、无法阻止晚期复制起始以及有丝分裂灾难增加，表明磷酸化的Ser4/Ser8状态对于执行ATR-Chk1检查点输出和保护基因组完整性是必需的。在此背景下，Ser4/Ser8突变体中复制应激诱导的超重组依赖于ATM，而其他缺陷则不依赖于ATM，这表明DNA-PK-RPA32 Ser4/Ser8磷酸化是协调ATR和ATM介导的对停滞复制反应的关键分支点。 RPA32 Ser4/Ser8 位点的磷酸化也参与同源重组修复的调控：DNA-PK、ATR 和 ATM 协同修饰 RPA32 的 N 端和 p53，从而释放 p53-RPA 复合物，促进 Rad51 的加载，并促进双链断裂的同源重组修复。这种机制通过协调调控 p53-RPA 的相互作用，为非同源末端连接和同源重组之间的相互作用提供了途径。G2 期细胞中 RPA32 Ser4/Ser8 位点的磷酸化影响 TopBP1 和 Rad9 在染色质上的积累、ATM 依赖的 KAP1 磷酸化以及 Rad51 在染色质上的加载，进一步强化了其作为 S 期后检查点信号传导和重组因子募集调节因子的作用。磷酸化 RPA32 Ser8（通常与 Ser4 一起评估）可作为复制压力和 DNA 损伤反应的机制标记，其状态反映 DNA-PK/ATR/ATM 轴的激活情况，并在功能上调节复制检查点的执行、复制叉重启时间、复制起点的使用以及重组和有丝分裂灾难之间的平衡。 |
| 参考文献 |
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