Phospho-Sin1 (Thr86) Antibody (Rabbit mAb) [L3G17]
目录号: F7073
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: Hela (serum-starved), Lane 2: Hela (serum-starved; hIGF-I, 100 ng/ml, 15 min), Lane 3: Hela (serum-starved; hIGF-I, 100 ng/ml, 15 min; λ phosphatase treated)
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB, IP |
| 反应性 |
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| Human, Mouse |
| 抗体类型 |
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| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
实际分子量
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59 kDa
78 kDa, 74 kDa
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| *为什么预测分子量和实际分子量会有不同？ 以下原因可能会导致蛋白分子量与预测不同：翻译后修饰（磷酸化/糖基化）；剪接变体和异构体；相对电荷；多聚体。 |
| 阳性对照 | NIH/3T3 cells (Serum starved; insulin, 150 nM, 5 min); NIH/3T3 cells (Serum starved; hIGF-I, 100 ng/ml, 5 min) |
|---|---|
| 阴性对照 | NIH/3T3 cells (Serum starved) |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
| Phospho-Sin1 (Thr86) Antibody (Rabbit mAb) [L3G17] 仅识别 Thr86 处磷酸化的内源性 Sin1 蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
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| 细胞膜，细胞质，内质网，内体，高尔基体，溶酶体 |
| Uniprot ID |
|---|
| Q9BPZ7 |
| 克隆号 |
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| L3G17 |
| 别名 |
|---|
| JC310; MAPK associated protein 1; MAPKAP1; MEKK2-interacting protein 1; MGC2745; MIP1; SIN1; SIN1b; SIN1g; Target of rapamycin complex 2 subunit MAPKAP1; TORC2 subunit MAPKAP1 |
| 背景 |
|---|
| Sin1 在苏氨酸 86 (Thr86) 位点的磷酸化是控制雷帕霉素靶蛋白复合物 2 (mTORC2) 的关键调控修饰。mTORC2 由 mTOR、rictor、Sin1 和 mLST8 组成，它通过磷酸化 AGC 激酶家族成员（包括丝氨酸 473 位点的 Akt）发挥着细胞存活、生长和细胞骨架组织的关键调控作用。Sin1 是 mTORC2 的重要支架蛋白，Thr86 位点和 Thr398 位点的磷酸化通过影响 Sin1 与其他复合物亚基结合的构象变化，调控整个 mTORC2 复合物的完整性和催化活性。 Thr86 磷酸化的功能后果仍然取决于细胞环境，出现了两种不同的调控范式——Akt 作为主要的激酶，在不同的细胞系和刺激条件下磷酸化 Sin1 的 Thr86 位点，建立了一个正反馈回路，其中 PDK1 介导的 Akt 在 Thr308 位点的磷酸化产生部分激活的 Akt，随后磷酸化 Sin1 的 Thr86 位点，增强 mTORC2 激酶活性，并通过 mTORC2 介导的 Ser473 位点的磷酸化实现 Akt 的完全激活。相反，mTORC1下游的S6K或Akt自身对Sin1的Thr86和Thr398位点的磷酸化会触发负调控，诱导Sin1从mTORC2复合物中解离，从而抑制mTORC2激酶活性，并抑制胰岛素、IGF-1、PDGF和EGF刺激下Akt在Ser473位点的磷酸化，建立一种不同于经典IRS-1和Grb10介导通路的反馈抑制机制。这种双重调控能力使Thr86磷酸化成为一个分子开关，根据上游信号强度、营养物质供应和生长因子环境来平衡mTORC2的激活和抑制。Sin1在Thr86位点的磷酸化状态调节mTORC2依赖的其他底物的磷酸化，包括SGK1在Ser422位点和PKCα在Ser657位点，从而将调控范围扩展到Akt之外，影响离子转运、细胞迁移和膜转运过程。 Sin1 Thr86磷酸化整合了来自mTORC1和生长因子受体通路的信号，通过mTORC1-S6K和mTORC2-Akt信号轴之间的相互作用，协调细胞对营养状态和促有丝分裂刺激的反应。Thr86磷酸化位点附近的癌症相关突变，例如从患者样本中发现的Sin1-R81T突变，会通过阻止有效磷酸化而损害磷酸化依赖性的负调控，导致mTORC2组成型过度激活和持续的Akt信号传导，从而驱动癌变转化、增殖和存活。 |
| 参考文献 |
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