Phospho-SLP-76 (Ser376) Antibody (Rabbit mAb) [D2F12]
目录号: F5023
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: Jurkat, Lane 2: Jurkat (CIP and λ phosphatase treated)
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB, FCM |
| 反应性 |
|---|
| Human |
| 抗体类型 |
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| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
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76 kDa
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| 阳性对照 | Jurkat cells (H2O2, 11 mM, 1 min); Human peripheral blood mononuclear cells (cross-linked anti-CD3 plus anti-CD28, 10 μg/mL, 15 min) |
|---|---|
| 阴性对照 |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
| Phospho-SLP-76 (Ser376) Antibody (Rabbit mAb) [D2F12] 仅识别 Ser376 处磷酸化的内源性 SLP-76 蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
|---|
| 细胞质 |
| Uniprot ID |
|---|
| Q13094 |
| 克隆号 |
|---|
| D2F12 |
| 别名 |
|---|
| Lymphocyte cytosolic protein 2, SH2 domain-containing leukocyte protein of 76 kDa, SLP-76 tyrosine phosphoprotein (SLP76), LCP2 |
| 背景 |
|---|
| 磷酸化SLP-76 (Ser376) 代表TCR支架蛋白SLP-76的一种负反馈状态，其中HPK1驱动的丝氨酸磷酸化将原本具有激活作用的衔接蛋白转化为14-3-3蛋白结合、泛素化和蛋白酶体降解的平台，从而解体LAT/SLP-76信号复合物，减弱TCR信号的强度和持续时间。SLP-76包含N端酸性基序和酪氨酸基序、富含脯氨酸的中央区域以及C端SH2结构域，这些结构共同协调TCR结合后ZAP-70磷酸化依赖性复合物与LAT、Vav、Nck、Itk和PLCγ1的组装；Ser376位于衔接蛋白的C端，磷酸化后构成典型的14-3-3识别基序的一部分。 TCR 连接后，被募集到 LAT/SLP-76 复合物的 HPK1 (MAP4K1) 以激酶活性依赖的方式磷酸化 SLP-76 的 Ser376 位点。这种修饰对于 14-3-3 衔接蛋白（如 14-3-3σ 和 14-3-3ε）与 SLP-76 的对接是必需的，这已通过对结合在 14-3-3 两亲性沟槽内的 Ser376 磷酸化肽的结构和生物物理表征得到证实。Ser376 磷酸化不仅促进 14-3-3 的结合，而且在持续的 TCR 信号传导过程中还会触发 SLP-76 的 Lys30 连接的泛素化及其蛋白酶体降解； Ser376 或 Lys30 的突变会降低 SLP-76 的泛素化水平，稳定接头蛋白，并导致 CD3 刺激后 ERK 和 JNK 的激活增强和延长，表明该丝氨酸磷酸化开关直接调节 TCR 下游的 MAPK 输出。HPK1 的破坏或药理学抑制显著降低了 Jurkat 细胞和原代人 CD8⁺ T 细胞中 SLP-76 Ser376 的磷酸化水平，并伴有 ERK 磷酸化的持续、IL-2 生成增加和 T 细胞活化增强。遗传学或生化证据表明，HPK1 的柠檬酸同源结构域有助于 SLP-76 的结合和 Ser376 的有效磷酸化。 |
| 参考文献 |
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