Phospho-Src Family (Tyr416) Antibody [D13C8]

目录号: F4136

抗体应用：反应性：Human, Mouse, Rat

Lane 1: C6, Lane 2: C6 (Pervanadate, 0.5 mM, 37℃, 40 min)

规格	价格	库存
20uL	790	现货
50uL	1240	现货
100uL	1990	现货
100uL*2	3790	现货
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使用信息

稀释比例
WB1:1000 IP1:100

抗体应用
WB, IP

反应性
Human, Mouse, Rat

抗体类型
Rabbit Monoclonal Antibody

储存液配方
PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件(自收到货起)
-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

预测分子量
60 kDa

阳性对照	Colo 201 cell; mIMCD-3 cell; KYSE-70 cell; NCI-H146 cell; CML-T1 cell
阴性对照	Colo 201 cell (Dasatinib, 200 nM, 24 h)

实验方法

WB
实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 120 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

Datasheet & SDS

生物描述

特异性
Phospho-Src Family (Tyr416) Antibody [D13C8] 仅识别 Tyr416 处磷酸化的内源性 Src Family 蛋白水平。

蛋白定位
细胞连接，细胞膜，细胞质，细胞骨架，线粒体，细胞核

Uniprot ID
P12931

克隆号
D13C8

别名
Proto-oncogene tyrosine-protein kinase Src; Proto-oncogene c-Src; pp60c-src (p60-Src); SRC; SRC1

背景
磷酸化Src家族（Tyr416）是指Src家族激酶（SFKs）的激活状态，SFKs包括Src、Lyn、Fyn、Yes、Lck、Blk和Hck，它们是非受体酪氨酸激酶，调控细胞生长、分化、存活以及来自细胞表面受体的信号转导。SFKs具有保守的结构，包括用于膜锚定的N端肉豆蔻酰化位点、独特的结构域、用于蛋白质和磷酸酪氨酸相互作用的SH3和SH2结构域，以及包含激活环的C端激酶（SH1）结构域，其中Tyr416（在人Src中为Tyr419）被磷酸化。Tyr416的磷酸化通常通过分子间自磷酸化实现，可稳定激活环，使其处于开放的、具有催化活性的构象，从而使激酶活性提高高达20倍，并驱动下游底物的磷酸化。这种激活性磷酸化与C端Tyr530（鸡为Tyr527）的抑制性磷酸化相平衡，后者促进分子内SH2结构域的结合，使激酶处于非活性状态；Tyr530的去磷酸化和Tyr416的磷酸化共同作用，使SFKs转变为活性形式。在这种状态下，磷酸化Src家族（Tyr416）激酶介导多种细胞过程，包括增殖、细胞骨架重排以促进迁移和黏附、免疫信号传导（例如通过Lck激活T细胞）以及细胞凋亡调控；而持续的失调激活则会导致癌症进展和持续的致癌信号传导。

背景

磷酸化Src家族（Tyr416）是指Src家族激酶（SFKs）的激活状态，SFKs包括Src、Lyn、Fyn、Yes、Lck、Blk和Hck，它们是非受体酪氨酸激酶，调控细胞生长、分化、存活以及来自细胞表面受体的信号转导。SFKs具有保守的结构，包括用于膜锚定的N端肉豆蔻酰化位点、独特的结构域、用于蛋白质和磷酸酪氨酸相互作用的SH3和SH2结构域，以及包含激活环的C端激酶（SH1）结构域，其中Tyr416（在人Src中为Tyr419）被磷酸化。Tyr416的磷酸化通常通过分子间自磷酸化实现，可稳定激活环，使其处于开放的、具有催化活性的构象，从而使激酶活性提高高达20倍，并驱动下游底物的磷酸化。这种激活性磷酸化与C端Tyr530（鸡为Tyr527）的抑制性磷酸化相平衡，后者促进分子内SH2结构域的结合，使激酶处于非活性状态；Tyr530的去磷酸化和Tyr416的磷酸化共同作用，使SFKs转变为活性形式。在这种状态下，磷酸化Src家族（Tyr416）激酶介导多种细胞过程，包括增殖、细胞骨架重排以促进迁移和黏附、免疫信号传导（例如通过Lck激活T细胞）以及细胞凋亡调控；而持续的失调激活则会导致癌症进展和持续的致癌信号传导。

参考文献
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/31331936/ https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/27387461/

PVDF膜孔径规格选择参照表

Protein Size (kDa)	PVDF Transfer Membrane Pore Size (μm)
< 10	0.22
10-20	0.22
20-30	0.45
30-45	0.45
45-70	0.45
80-100	0.45
100-140	0.45
> 140	0.45

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* 必填项

Protein Size (kDa)	Separating Gel Percentage
4-40	20%
12-45	15%
10-70	12.5%
15-100	10%
25-100	8%
60-210	5%