Phospho-Tyrosine Antibody (Mouse mAb) [N16H13]

目录号: F3510

抗体应用：反应性：All Species Expected

规格	价格	库存
20uL	790	现货
50uL	1240	现货
100uL	1990	现货
100uL*2	3790	现货
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使用信息

稀释比例
WB1:2000 IP1:100 IHC1:2400 - 1:9600 IF1:1600 - 1:3200 FCM1:1600 - 1:6400

抗体应用
WB, IP, IHC, IF, FCM

反应性
All Species Expected

抗体类型
Mouse Monoclonal Antibody

储存液配方
PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件(自收到货起)
-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

阳性对照	Human breast carcinoma; Human lung carcinoma; Human B-cell non-Hodgkin lymphoma; Human squamous cell lung carcinoma; Human soft tissue squamous cell carcinoma; Normal human kidney; Normal human lung; NCI-H1650 xenograft; Jurkat cells (pervanadate, 1 mM, 30 min prior to lysis); KYSE450 cells (EGF treated); NCI-H1650 xenograft
阴性对照	HeLa cells; KYSE450 cells

实验方法

WB
实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的组织裂解液（含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的细胞裂解液（含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的细胞裂解液（含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。 PVDF 膜孔径规格选择参照表（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:2000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的组织裂解液（含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的细胞裂解液（含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的细胞裂解液（含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。 PVDF 膜孔径规格选择参照表

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:2000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

Datasheet & SDS

生物描述

特异性
Phospho-Tyrosine Antibody (Mouse mAb) [N16H13] 可检测多种酪氨酸磷酸化蛋白质和肽。

克隆号
N16H13

背景
磷酸酪氨酸是蛋白质中氨基酸酪氨酸的O-磷酸化形式，在真核生物调控网络中发挥着核心模块化信号的作用。其可逆的形成和特定结构域的识别控制着细胞通讯、生长和分化的诸多方面。这种修饰位于蛋白质侧链酪氨酸的酚羟基上，由蛋白酪氨酸激酶和蛋白酪氨酸磷酸酶组成的三元工具包以及Src同源结构域2和相关的磷酸酪氨酸结合结构域共同完成。这些结构域能够读取磷酸酪氨酸基序并组装信号复合物；这种结构形成了一个高度互联的组合编码，使细胞能够对细胞外信号做出特定的反应。受体和非受体酪氨酸激酶中的酪氨酸磷酸化为含有SH2和PTB结构域的衔接蛋白和酶创造了对接位点，从而将配体诱导的受体激活与下游级联反应（例如RAS-RAF-MEK-ERK、PI3K-AKT、JAK-STAT和PLCγ-Ca²⁺信号通路）偶联起来，使得受体和支架上的磷酸酪氨酸模式能够决定通路选择和信号强度。对人类磷酸酪氨酸网络的大规模分析表明，一组磷酸酪氨酸基序和SH2结构域特异性在激活的受体和细胞质信号枢纽中形成相互连接的蛋白簇，而条件性的磷酸酪氨酸依赖性相互作用则形成通路分支和反馈环路，协调受体转运、细胞骨架重塑、转录激活和代谢适应。磷酸酪氨酸位点的丰度和分布受到激酶和经典蛋白酪氨酸磷酸酶之间平衡的严格调控。这些经典蛋白酪氨酸磷酸酶的催化结构域对磷酸酪氨酸具有高度选择性，它们通过使受体、中间体和转录因子去磷酸化来终止或重塑信号传导。这种平衡的改变会导致持续性或缺陷性信号传导。比较基因组学和进化分析表明，完整的磷酸酪氨酸工具包在多细胞动物起源时显著扩展，酪氨酸激酶、磷酸酶和SH2结构域蛋白的协同增加与更复杂的细胞间和细胞-基质通讯相关，凸显了磷酸酪氨酸作为后生动物信号传导复杂性的关键创新。酪氨酸激酶的突变、过表达或异常激活以及磷酸酶的丢失或失调导致磷酸酪氨酸信号传导失调，这是许多癌症、免疫疾病和代谢疾病的标志，其中改变的磷酸酪氨酸环境驱动致癌信号传导、抗凋亡、异常免疫激活或胰岛素和瘦素反应受损。

背景

磷酸酪氨酸是蛋白质中氨基酸酪氨酸的O-磷酸化形式，在真核生物调控网络中发挥着核心模块化信号的作用。其可逆的形成和特定结构域的识别控制着细胞通讯、生长和分化的诸多方面。这种修饰位于蛋白质侧链酪氨酸的酚羟基上，由蛋白酪氨酸激酶和蛋白酪氨酸磷酸酶组成的三元工具包以及Src同源结构域2和相关的磷酸酪氨酸结合结构域共同完成。这些结构域能够读取磷酸酪氨酸基序并组装信号复合物；这种结构形成了一个高度互联的组合编码，使细胞能够对细胞外信号做出特定的反应。受体和非受体酪氨酸激酶中的酪氨酸磷酸化为含有SH2和PTB结构域的衔接蛋白和酶创造了对接位点，从而将配体诱导的受体激活与下游级联反应（例如RAS-RAF-MEK-ERK、PI3K-AKT、JAK-STAT和PLCγ-Ca²⁺信号通路）偶联起来，使得受体和支架上的磷酸酪氨酸模式能够决定通路选择和信号强度。对人类磷酸酪氨酸网络的大规模分析表明，一组磷酸酪氨酸基序和SH2结构域特异性在激活的受体和细胞质信号枢纽中形成相互连接的蛋白簇，而条件性的磷酸酪氨酸依赖性相互作用则形成通路分支和反馈环路，协调受体转运、细胞骨架重塑、转录激活和代谢适应。磷酸酪氨酸位点的丰度和分布受到激酶和经典蛋白酪氨酸磷酸酶之间平衡的严格调控。这些经典蛋白酪氨酸磷酸酶的催化结构域对磷酸酪氨酸具有高度选择性，它们通过使受体、中间体和转录因子去磷酸化来终止或重塑信号传导。这种平衡的改变会导致持续性或缺陷性信号传导。比较基因组学和进化分析表明，完整的磷酸酪氨酸工具包在多细胞动物起源时显著扩展，酪氨酸激酶、磷酸酶和SH2结构域蛋白的协同增加与更复杂的细胞间和细胞-基质通讯相关，凸显了磷酸酪氨酸作为后生动物信号传导复杂性的关键创新。酪氨酸激酶的突变、过表达或异常激活以及磷酸酶的丢失或失调导致磷酸酪氨酸信号传导失调，这是许多癌症、免疫疾病和代谢疾病的标志，其中改变的磷酸酪氨酸环境驱动致癌信号传导、抗凋亡、异常免疫激活或胰岛素和瘦素反应受损。

参考文献
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/22194470/ https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/20813250/

PVDF膜孔径规格选择参照表

Protein Size (kDa)	PVDF Transfer Membrane Pore Size (μm)
< 10	0.22
10-20	0.22
20-30	0.45
30-45	0.45
45-70	0.45
80-100	0.45
100-140	0.45
> 140	0.45

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* 必填项

Protein Size (kDa)	Separating Gel Percentage
4-40	20%
12-45	15%
10-70	12.5%
15-100	10%
25-100	8%
60-210	5%