Phospho-VEGF Receptor 2 (Tyr1059) Antibody [J6L3]

目录号: F0806

抗体应用：反应性：Human, Mouse

Lane 1: HT-29, Lane 2: HT-29 (SCF-1 treated)

规格	价格	库存
20uL	790	现货
50uL	1240	现货
100uL	1990	现货
100uL*2	3790	现货
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操作要点

WB
建议 SDS-PAGE 分离胶浓度：5%。
湿转参考条件：250 mA, 180 min。

使用信息

稀释比例
WB1:1000

抗体应用
WB

反应性
Human, Mouse

抗体类型
Rabbit Monoclonal Antibody

储存液配方
PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件(自收到货起)
-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

预测分子量
230 kDa

阳性对照	PAE/CKR cells (CSF-1 treated)
阴性对照	PAE/CKR cells

实验方法

WB
实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：250 mA, 180 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：250 mA, 180 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

Datasheet & SDS

生物描述

特异性
Phospho-VEGF Receptor 2 (Tyr1059) Antibody [J6L3] 仅识别 Tyr1059 处磷酸化的内源性 VEGF Receptor 2 蛋白水平。

蛋白定位
细胞连接，细胞膜，细胞质，胞质囊泡，内质网，内膜系统，细胞核，细胞外环境

Uniprot ID
P35968

克隆号
J6L3

别名
Vascular endothelial growth factor receptor 2; VEGFR-2; Fetal liver kinase 1; FLK-1; Kinase insert domain receptor; KDR; Protein-tyrosine kinase receptor flk-1; CD309; KDR; FLK1

背景
磷酸化VEGF受体2 (Tyr1059) 指的是血管内皮生长因子受体2 (VEGFR2) 的活化形式，其中位于激酶结构域活化环内的酪氨酸1059被磷酸化。VEGFR2是一种III类受体酪氨酸激酶，是血管发育、血管生成和血管通透性的主要介质。VEGFR2由胞外区（包含七个免疫球蛋白样基序）、单个跨膜区段和胞内尾（包含一个分裂的酪氨酸激酶结构域）组成。当VEGF-A与其胞外结构域结合时，VEGFR2发生二聚化，并在多个胞内酪氨酸残基上发生自身磷酸化，其中Tyr1059的磷酸化是增强激酶结构域催化活性的关键事件。这种磷酸化会触发多个下游信号级联反应，包括PLCγ-PKC-MAPK和PI3K/Akt通路。通过这些通路，磷酸化VEGFR2（Tyr1059）调控内皮细胞的关键行为，例如存活、增殖、迁移和血管通透性。VEGFR2在Tyr1059位点的激活是血管生成的核心驱动因素，它能够促进胚胎发育、伤口愈合和组织修复过程中新血管的形成。然而，在病理性血管生成中，例如实体瘤和炎症性疾病中，经常观察到磷酸化VEGFR2（Tyr1059）的持续或异常激活，这会导致血管不受控制地生长和血管通透性增加。磷酸化Tyr1059 VEGFR2是VEGFR2信号通路激活的关键生物标志物，也是重要的治疗靶点。针对这种磷酸化事件的抑制剂可用于抑制癌症和眼部疾病中的异常血管生成。

背景

磷酸化VEGF受体2 (Tyr1059) 指的是血管内皮生长因子受体2 (VEGFR2) 的活化形式，其中位于激酶结构域活化环内的酪氨酸1059被磷酸化。VEGFR2是一种III类受体酪氨酸激酶，是血管发育、血管生成和血管通透性的主要介质。VEGFR2由胞外区（包含七个免疫球蛋白样基序）、单个跨膜区段和胞内尾（包含一个分裂的酪氨酸激酶结构域）组成。当VEGF-A与其胞外结构域结合时，VEGFR2发生二聚化，并在多个胞内酪氨酸残基上发生自身磷酸化，其中Tyr1059的磷酸化是增强激酶结构域催化活性的关键事件。这种磷酸化会触发多个下游信号级联反应，包括PLCγ-PKC-MAPK和PI3K/Akt通路。通过这些通路，磷酸化VEGFR2（Tyr1059）调控内皮细胞的关键行为，例如存活、增殖、迁移和血管通透性。VEGFR2在Tyr1059位点的激活是血管生成的核心驱动因素，它能够促进胚胎发育、伤口愈合和组织修复过程中新血管的形成。然而，在病理性血管生成中，例如实体瘤和炎症性疾病中，经常观察到磷酸化VEGFR2（Tyr1059）的持续或异常激活，这会导致血管不受控制地生长和血管通透性增加。磷酸化Tyr1059 VEGFR2是VEGFR2信号通路激活的关键生物标志物，也是重要的治疗靶点。针对这种磷酸化事件的抑制剂可用于抑制癌症和眼部疾病中的异常血管生成。

参考文献
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/16633338/ https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/22366328/

PVDF膜孔径规格选择参照表

Protein Size (kDa)	PVDF Transfer Membrane Pore Size (μm)
< 10	0.22
10-20	0.22
20-30	0.45
30-45	0.45
45-70	0.45
80-100	0.45
100-140	0.45
> 140	0.45

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* 必填项

Protein Size (kDa)	Separating Gel Percentage
4-40	20%
12-45	15%
10-70	12.5%
15-100	10%
25-100	8%
60-210	5%