PI3 Kinase Class III Antibody [C6E8]

目录号: F4178

抗体应用：反应性：Human, Mouse, Rat, Monkey

Lane 1: 293

规格	价格	库存
20uL	790	现货
50uL	1240	现货
100uL	1990	现货
100uL*2	3790	现货
400-668-6834 info@selleck.cn

使用信息

稀释比例
WB1:1000

抗体应用
WB

反应性
Human, Mouse, Rat, Monkey

抗体类型
Rabbit Monoclonal Antibody

储存液配方
PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件(自收到货起)
-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

预测分子量
100 kDa

阳性对照	293 cells; RN33B cells
阴性对照

实验方法

WB
实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 120 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

Datasheet & SDS

生物描述

特异性
PI3 Kinase Class III Antibody [C6E8] 可检测内源性 PI3 Kinase Class III 总蛋白水平。

蛋白定位
胞质囊泡，内体

Uniprot ID
Q8NEB9

克隆号
C6E8

别名
Phosphatidylinositol 3-kinase catalytic subunit type 3; PI3-kinase type 3; PI3K type 3; PtdIns-3-kinase type 3; Phosphatidylinositol 3-kinase p100 subunit; Phosphoinositide-3-kinase class 3; hVps34; PIK3C3; VPS34

背景
PI3激酶III类，也称为VPS34或PIK3C3，是磷脂酰肌醇3-激酶家族中该类唯一的成员，是酵母Vps34的哺乳动物对应物。它与调节亚基VPS15（p150）配对，VPS15是一种丝氨酸/苏氨酸激酶样蛋白，其N端经过肉豆蔻酰化修饰以靶向细胞膜。其催化核心包含一个螺旋结构域、一个带有保守HRD基序（用于ATP结合）的C端脂质激酶结构域，以及一个活性位点，该活性位点可磷酸化磷脂酰肌醇（PI）的3位，生成PI(3)P。VPS15通过与VPS34 N端结构域的相互作用来稳定VPS34，而PI(3)P的生成则将FYVE和PX结构域效应蛋白（如EEA1）募集到内体区室。冷冻电镜揭示了不同的复合物：PI3KC3-C1（包含VPS34-VPS15-Beclin1-ATG14L）通过富含PI(3)P的ω体驱动内质网中的自噬体成核；PI3KC3-C2（包含VPS34-VPS15-Beclin1-UVRAG-Rubicon）则促进内体成熟，最终与溶酶体融合。VPS34产生PI(3)P梯度，这对于囊泡运输、早期内体中的蛋白质分选以及胞质分裂的完成至关重要。在自噬过程中，PI(3)P与WIPI2共同构建PI3P效应复合物（PEC），促进吞噬泡扩张和LC3脂化，从而将营养感知与受损细胞器的降解联系起来。它与 mTORC1 整合，在氨基酸充足时抑制自噬，并在饥饿时通过 Beclin1 去磷酸化激活自噬。三聚体 G 蛋白信号通过 Ric-8A 调节 VPS34，将受体激活与膜动力学联系起来。VPS34 与多种疾病相关，例如癌症（VPS34 单倍体不足会损害肿瘤抑制）、神经退行性疾病（PI(3)P 缺乏会破坏淀粉样蛋白清除）以及免疫性疾病（克罗恩病模型中吞噬作用缺陷）。VPS34 过度活跃可通过生长因子受体的内体运输促进转移，而像沃特曼宁这样的抑制剂则可在治疗中阻断自噬通量。肉豆蔻酰化的 VPS15 结合 GTP，变构解除自身抑制，从而暴露 VPS34 活性位点靠近膜的位置。这些作用使 III 类 PI3 激酶处于分解代谢、运输和应激适应的关键节点。

背景

PI3激酶III类，也称为VPS34或PIK3C3，是磷脂酰肌醇3-激酶家族中该类唯一的成员，是酵母Vps34的哺乳动物对应物。它与调节亚基VPS15（p150）配对，VPS15是一种丝氨酸/苏氨酸激酶样蛋白，其N端经过肉豆蔻酰化修饰以靶向细胞膜。其催化核心包含一个螺旋结构域、一个带有保守HRD基序（用于ATP结合）的C端脂质激酶结构域，以及一个活性位点，该活性位点可磷酸化磷脂酰肌醇（PI）的3位，生成PI(3)P。VPS15通过与VPS34 N端结构域的相互作用来稳定VPS34，而PI(3)P的生成则将FYVE和PX结构域效应蛋白（如EEA1）募集到内体区室。冷冻电镜揭示了不同的复合物：PI3KC3-C1（包含VPS34-VPS15-Beclin1-ATG14L）通过富含PI(3)P的ω体驱动内质网中的自噬体成核；PI3KC3-C2（包含VPS34-VPS15-Beclin1-UVRAG-Rubicon）则促进内体成熟，最终与溶酶体融合。VPS34产生PI(3)P梯度，这对于囊泡运输、早期内体中的蛋白质分选以及胞质分裂的完成至关重要。在自噬过程中，PI(3)P与WIPI2共同构建PI3P效应复合物（PEC），促进吞噬泡扩张和LC3脂化，从而将营养感知与受损细胞器的降解联系起来。它与 mTORC1 整合，在氨基酸充足时抑制自噬，并在饥饿时通过 Beclin1 去磷酸化激活自噬。三聚体 G 蛋白信号通过 Ric-8A 调节 VPS34，将受体激活与膜动力学联系起来。VPS34 与多种疾病相关，例如癌症（VPS34 单倍体不足会损害肿瘤抑制）、神经退行性疾病（PI(3)P 缺乏会破坏淀粉样蛋白清除）以及免疫性疾病（克罗恩病模型中吞噬作用缺陷）。VPS34 过度活跃可通过生长因子受体的内体运输促进转移，而像沃特曼宁这样的抑制剂则可在治疗中阻断自噬通量。肉豆蔻酰化的 VPS15 结合 GTP，变构解除自身抑制，从而暴露 VPS34 活性位点靠近膜的位置。这些作用使 III 类 PI3 激酶处于分解代谢、运输和应激适应的关键节点。

参考文献
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/22308354/ https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/30397185/

PVDF膜孔径规格选择参照表

Protein Size (kDa)	PVDF Transfer Membrane Pore Size (μm)
< 10	0.22
10-20	0.22
20-30	0.45
30-45	0.45
45-70	0.45
80-100	0.45
100-140	0.45
> 140	0.45

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* 必填项

Protein Size (kDa)	Separating Gel Percentage
4-40	20%
12-45	15%
10-70	12.5%
15-100	10%
25-100	8%
60-210	5%