pro Caspase-1+p10+p12 Antibody (Rabbit mAb) [H3L1]
目录号: F1539
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: THP-1 (LPS, 0.1 µg/mL, 3 h; ATP, 5 mM, 15 min)
操作要点
procaspase-1 基因转录产物可发生选择性剪接，进而生成多种不同亚型（isoforms）。各亚型蛋白分子量存在差异，因此在蛋白电泳检测中可于 30~45 kDa 区间观察到多条特异性条带；其中分子量为 50 kDa 的条带，对应表达最为广泛的亚型 caspase-1 α。
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB, IP |
| 反应性 |
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| Mouse, Rat, Human |
| 抗体类型 |
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| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
实际分子量
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45 kDa
10 kDa, 30-45kDa, 50kDa
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| *为什么预测分子量和实际分子量会有不同？ 以下原因可能会导致蛋白分子量与预测不同：翻译后修饰（磷酸化/糖基化）；剪接变体和异构体；相对电荷；多聚体。 |
| 阳性对照 | Rat lung tissue; Human fetal lung tissue; Rat spleen tissue; Mouse spleen tissue; Mouse brain tissue; Rat brain tissue; RAW 264.7 cells; THP-1 cells; J774A.1 cells |
|---|---|
| 阴性对照 | NCI-H1299 cells; A549 cells |
实验方法
| WB |
|---|
实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
| pro Caspase-1+p10+p12 Antibody (Rabbit mAb) [H3L1] 可检测内源性 pro Caspase-1+p10+p12 总蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
|---|
| 细胞膜，细胞质，内膜系统 |
| Uniprot ID |
|---|
| P29466 |
| 克隆号 |
|---|
| H3L1 |
| 别名 |
|---|
| IL1BC, IL1BCE, CASP1, Caspase-1, CASP-1, Interleukin-1 beta convertase, Interleukin-1 beta-converting enzyme, p45, IL-1BC, ICE, IL-1 beta-converting enzyme |
| 背景 |
|---|
| 前体 caspase-1 是炎症 caspase-1 的无活性酶原，包含一个 N 端 caspase 募集结构域 (CARD)，其后是一个大的催化亚基 (p20) 和一个小的亚基 (p10/p12 区)。术语“前体 caspase-1 + p10 + p12”指的是检测全长前体及其加工后的小亚基，它们共同定义了炎症小体通路中 caspase-1 的激活状态。该酶原存在于髓系细胞和其他细胞的胞质溶胶中，并通过CARD-CARD相互作用被募集到由模式识别受体（如NLRP3、NLRC4、AIM2或其他NLR）和衔接蛋白ASC构建的炎症小体平台上。这些炎症小体平台将多个前体caspase-1分子聚集在一起，并在特定的内部天冬氨酸残基处促进其自身蛋白水解加工，生成p20和p10/p12片段，这些片段组装成一个活性异源四聚体。活性酶将IL-1β和IL-18的前体切割成成熟的分泌型细胞因子，并加工gasdermin D以释放其N端成孔结构域。因此，caspase-1通过其p20/p10复合物的激活，将病原体或损伤相关分子模式的感知与关键促炎细胞因子的分泌以及细胞焦亡（一种溶解性细胞死亡）偶联起来，从而促进病原体的清除和炎症信号传导。除了经典的炎症小体之外，caspase-1 还参与其他激活途径，与 RIP2 和 NF-κB 信号通路组分相互作用，并能影响糖酵解酶、caspase-7 的激活以及非常规蛋白分泌，这表明其在代谢适应、细胞存活和非经典分泌中发挥着更广泛的作用，且这种作用具有情境依赖性。因此，未加工的前体形式与含有 p10/p12 的活性亚基之间的平衡，可以直接反映组织和实验系统中炎症小体的参与和 caspase-1 的激活状态。识别前体 caspase-1 和 p10/p12 区域中表位的抗体，可以同时检测这两种形式，从而在一次检测中监测酶原的可用性和激活相关的切割情况。 caspase-1 活性失调会导致自身炎症性疾病和炎症性疾病，包括冷吡啉相关周期性综合征、痛风、类风湿性关节炎、炎症性肠病、肥胖相关代谢紊乱、心血管疾病和某些癌症，其机制是通过 IL-1β/IL-18 过度产生和细胞焦亡；而 caspase-1 活性不足则会损害宿主对细菌和病毒感染的防御能力。 |
| 参考文献 |
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