Profilin-1 Antibody [P24C16]
目录号: F5342
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: Hela, Lane 2: COS, Lane 3: C6, Lane 4: CHO
操作要点
WB
建议 SDS-PAGE 分离胶浓度：20%。
湿转参考条件：200 mA, 60 min，建议使用 0.22 μm PVDF膜。
建议 SDS-PAGE 分离胶浓度：20%。
湿转参考条件：200 mA, 60 min，建议使用 0.22 μm PVDF膜。
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
|---|
| WB |
| 反应性 |
|---|
| Human, Mouse, Rat, Hamster, Monkey, Dog |
| 抗体类型 |
|---|
| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
|---|
| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
|---|
| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
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15 kDa
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| 阳性对照 | HeLa cells; NIH/3T3 cells; C6 cells; COS cells; CHO cells; MDCK cells |
|---|---|
| 阴性对照 |
实验方法
| WB |
|---|
实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：20 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.22 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 60 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
| Profilin-1 Antibody [P24C16] 可检测内源性 Profilin-1 总蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
|---|
| 细胞质，细胞骨架 |
| Uniprot ID |
|---|
| P07737 |
| 克隆号 |
|---|
| P24C16 |
| 别名 |
|---|
| Profilin-1; Epididymis tissue protein Li 184a; Profilin I; PFN1 |
| 背景 |
|---|
| Profilin-1是profilin家族中普遍表达的成员，该家族是一类肌动蛋白单体结合蛋白，它作为肌动蛋白细胞骨架动力学的核心调控因子，对细胞运动、分裂和黏附至关重要。Profilin-1具有紧凑的球状折叠结构，其独特的肌动蛋白结合位点、聚脯氨酸配体（PLP）结合位点和磷脂酰肌醇结合位点能够螯合G-肌动蛋白并促进核苷酸从ADP到ATP的交换。Profilin-1将ATP-G-肌动蛋白递送至生长丝的带刺端，同时抑制自发成核，优先将单体引导至Ena/VASP和formin通路，而非Arp2/3复合物的组装；这种机制通过抑制Arp2/3驱动的片状伪足形成，同时促进VASP介导的前缘突起形成，从而维持细胞稳态平衡。这种促进作用是通过黏附依赖性的PKA调控相互作用实现的，从而增强F-肌动蛋白的积累，而不改变细胞内F-肌动蛋白的总量。 Profilin-1还能与palladin和dynamin-1中的多聚脯氨酸基序结合，协调肌动蛋白膜重塑和内吞作用。S137位点的磷酸化可微调其与PLP伴侣（如VASP）的亲和力，从而维持定向迁移。Profilin-1通过确保胞质分裂和极性所需的肌动蛋白通量来调控胚胎卵裂和囊胚形成。在迁移细胞中，它决定着对免疫监视和伤口愈合至关重要的突起-回缩周期，因此是研究肌动蛋白通路竞争的理想靶点，因为同工型冗余揭示了其在特定环境下的作用。Profilin-1的缺失会导致Arp2/3活性升高，破坏体内平衡，并在2细胞期引发胚胎致死；而突变则会在肌萎缩侧索硬化症（ALS）中损害神经元运输。 |
| 参考文献 |
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