Protein A Antibody (Mouse mAb) [E20E21]
目录号: F7725
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: Commercial Protein A
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB, ELISA |
| 反应性 |
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| staphylococcus aureus |
| 抗体类型 |
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| Mouse Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
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56 kDa
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实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的组织裂解液（含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的细胞裂解液（含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的细胞裂解液（含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。 PVDF 膜孔径规格选择参照表
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:2000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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生物描述
| 特异性 |
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| Protein A Antibody (Mouse mAb) [E20E21] 可检测细菌来源或重组的 Protein A。 |
| 蛋白定位 |
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| 细胞壁，细胞外环境 |
| Uniprot ID |
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| P02976 |
| 克隆号 |
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| E20E21 |
| 别名 |
|---|
| Immunoglobulin G-binding protein A, IgG-binding protein A, Staphylococcal protein A (SpA), spa |
| 背景 |
|---|
| 蛋白A (SpA) 是金黄色葡萄球菌表面锚定成分，是该菌免疫逃逸的核心分子。该蛋白由一系列高度同源的三螺旋束免疫球蛋白结合域组成，这些结构域从细胞壁向外突出，并通过嵌入肽聚糖中的X区和分选序列锚定。每个免疫球蛋白结合域通过螺旋I和II与IgG的Fc区在CH2-CH3界面结合，该位点与新生儿Fc受体FcRn识别的表位重叠；同时，螺旋II和III介导与携带VH3家族重链的抗体Fab区的平行结合。 SpA占据CH2-CH3界面，通过空间位阻阻断IgG与中性粒细胞和其他吞噬细胞上的FcγR结合，并同时阻碍FcRn的识别，从而破坏通常驱动调理吞噬清除的两个受体系统。除了阻断Fc受体结合外，SpA还会干扰IgG六聚体在细菌表面的组装，而这一过程对于有效募集和激活补体成分C1至关重要，从而抑制下游补体介导的调理作用和细菌杀灭。同样的IgG结合域也使SpA的作用范围超越了抗体隔离：它们与宿主细胞上的TNFR1结合，触发趋化因子表达，并驱动TNF转化酶依赖性的可溶性TNFR1脱落，这种反应会抑制局部炎症信号，尤其是在肺组织中。保守的IgG结合残基的替换会降低TNFR1的激活和Fc片段的捕获，从而将SpA的炎症和免疫逃逸功能与一个共同的结构界面联系起来。Ig结合区域还介导SpA与血管性血友病因子结构域的结合，使该蛋白与剪切应力下的血小板黏附相关，并使其在宿主-病原体相互作用中的作用扩展到免疫球蛋白系统之外。 |
| 参考文献 |
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