PSMB6 Antibody (Rabbit mAb) [G20N21]
目录号: F7058
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: NCI-H460, Lane 2: Caco 2, Lane 3: HeLa
操作要点
WB
湿转参考条件：200 mA, 60 min。
湿转参考条件：200 mA, 60 min。
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB, IF |
| 反应性 |
|---|
| Human |
| 抗体类型 |
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| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
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25 kDa
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| 阳性对照 | HeLa cells; Human fetal liver cells; NCI-H460 cells; Caco 2 cells |
|---|---|
| 阴性对照 |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 在 20 μL 样品中加入蛋白上样缓冲液，可直接冰上备用；或通过温度梯度（如37 ℃煮样、50 ℃煮样、70 ℃煮样、90 ℃煮样、100 ℃煮样）来确定最佳变性条件，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 60 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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| IF |
|---|
实验步骤：
样品准备
1. 贴壁细胞：取洁净无菌盖玻片置于培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片。
2. 悬浮细胞：将细胞接种至多聚赖氨酸包被的洁净无菌载玻片上。
3. 冰冻切片：将玻片置于室温下解冻，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。
4. 石蜡切片：先将玻片脱蜡至水，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。然后进行抗原修复。
固定
1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室温固定细胞爬片/涂片或组织切片 10~15 min。
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
封闭
添加封闭液，在室温下封闭至少 1 h。（常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或山羊血清。）
注意事项：从封闭开始之后的所有步骤务必保证样品湿润，避免干燥，否则极易产生高背景。
免疫荧光染色（第一天）
1. 吸走封闭液，滴加稀释后的一抗。
2. 湿盒中 4°C 孵育过夜。
免疫荧光染色（第二天）
1. 吸走一抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
2. 滴加稀释后的荧光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。
3. 吸走二抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
4. 滴加稀释后的 DAPI，室温避光 孵育 5~10 min。
5. PBST 中摇洗 3 次，每次 5 分钟。
封片
1. 抗荧光淬灭封片剂封片。
2. 干燥玻片，将玻片置于室温下避光过夜。
3. 将载玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。
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生物描述
| 特异性 |
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| PSMB6 Antibody (Rabbit mAb) [G20N21] 可检测内源性 PSMB6 总蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
|---|
| 细胞膜，内膜系统 |
| Uniprot ID |
|---|
| P28072 |
| 克隆号 |
|---|
| G20N21 |
| 别名 |
|---|
| DELTA | LMPY | Macropain delta chain | MGC5169 | Multicatalytic endopeptidase complex delta chain | proteasome (prosome | macropain) subunit | beta type | 6 | proteasome 20S subunit beta 6 | proteasome catalytic subunit 1 | Proteasome delta chain | proteasome subunit beta 6 | Proteasome subunit beta type-6 | proteasome subunit beta1 | proteasome subunit delta | Proteasome subunit Y | PSB6 | PSMB6 | PSY large multifunctional protease Y | Y |
| 背景 |
|---|
| 蛋白酶体20S β6 (PSMB6) 是20S核心蛋白酶体的组成型β亚基，是主要的ATP/泛素依赖性蛋白水解机制的关键组成部分，负责降解大多数细胞内蛋白质并维持蛋白质稳态。在四环结构的20S核心蛋白酶体中，PSMB6位于β环上，具有类似半胱天冬酶或酸性肽后谷氨酰水解活性，能够切割酸性残基后的肽键，从而影响蛋白酶体产生的肽的整体谱系。含有PSMB6的20S核心与两个19S调节颗粒结合形成26S蛋白酶体。26S蛋白酶体识别泛素化的底物，将其展开并转运至催化腔。在催化腔内，PSMB6和其他β亚基协同作用，清除错误折叠或受损的蛋白质以及不再需要的蛋白质，从而支持细胞周期进程、转录调控和应激反应等过程。含有PSMB6的20S核心还可以与PA28或PA200调节复合物结合，从而实现不依赖于泛素的蛋白水解。其中，20S-PA28复合物参与生成部分MHC I类分子呈递的抗原肽，而20S-PA200复合物则支持精子发生。这些发现凸显了含有PSMB6的核心在一般蛋白质稳态和抗原加工途径中的重要作用。在免疫细胞中，干扰素-γ和其他促炎细胞因子诱导免疫蛋白酶体催化亚基PSMB9、PSMB10和PSMB8的表达，这些亚基取代20S核心中的组成型β1、β2和β5亚基（包括PSMB6），形成免疫蛋白酶体；这种重塑降低了类半胱天冬酶活性，增强了类胰凝乳蛋白酶和类胰蛋白酶活性，从而形成有利于肽段加载到MHC I类分子上的C端切割模式。在功能层面，PSMB6作为标准蛋白酶体的组成部分，参与COP1自降解、CDK介导的Cdc6磷酸化和去除等通路，将蛋白酶体的周转与E3连接酶和复制许可因子的调控整合在一起。在对溴氰菊酯具有抗性的蚊细胞中，实验性抑制或敲低PSMB6会增加蚊细胞对杀虫剂的敏感性，并降低处理后的细胞活力。这表明，含有PSMB6的蛋白酶体支持该模型中的应激适应和外源性物质抗性，并且蛋白酶体抑制剂（如硼替佐米或MG-132）可通过靶向PSMB6依赖性蛋白水解与溴氰菊酯产生协同作用。蛋白酶体20S β6作为嵌入组成型20S核心的类半胱天冬酶催化亚基，参与ATP/泛素依赖性和非依赖性蛋白水解，在炎症反应期间被免疫蛋白酶体中的诱导型β1i取代，并参与从蛋白质质量控制和复制因子周转到外源性物质抗性和抗原肽生成等多种通路。 |
| 参考文献 |
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