PSMC2 Antibody (Mouse mAb) [A15H16]
目录号: F9368
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: Hela, Lane 2: MCF7, Lane 3: HepG2, Lane 4: Daudi
操作要点
WB
建议一抗稀释比: 1:100
建议曝光 90s 以上。
建议一抗稀释比: 1:100
建议曝光 90s 以上。
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
|---|
| WB, IP, IF, ELISA |
| 反应性 |
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| Human, Mouse, Rat |
| 抗体类型 |
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| Mouse Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
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49 kDa
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| 阳性对照 | HeLa cells; MCF7 cells; HepG2 cells; Daudi cells; K‑562 cells; EOC 20 cells; C6 cells; PC‑12 cells; Sol8 cells |
|---|---|
| 阴性对照 |
实验方法
| WB |
|---|
实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:100），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。 (建议曝光时长 90s 以上)。
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| IF |
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实验步骤：
样品准备
1. 贴壁细胞：取洁净无菌盖玻片置于培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片。
2. 悬浮细胞：将细胞接种至多聚赖氨酸包被的洁净无菌载玻片上。
3. 冰冻切片：将玻片置于室温下解冻，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。
4. 石蜡切片：先将玻片脱蜡至水，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。然后进行抗原修复。
固定
1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室温固定细胞爬片/涂片或组织切片 10~15 min。
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
通透
1. 对样品添加去垢剂，如 0.1~0.3% Triton X-100，室温通透 10~20 min。
（仅针对胞内抗原，若是细胞膜上表达的抗原则可省略该步骤。）
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
封闭
添加封闭液，在室温下封闭至少 1 h。（常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或山羊血清。）
注意事项：从封闭开始之后的所有步骤务必保证样品湿润，避免干燥，否则极易产生高背景。
免疫荧光染色（第一天）
1. 吸走封闭液，滴加稀释后的一抗。
2. 湿盒中 4°C 孵育过夜。
免疫荧光染色（第二天）
1. 吸走一抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
2. 滴加稀释后的荧光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。
3. 吸走二抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
4. 滴加稀释后的 DAPI，室温避光 孵育 5~10 min。
5. PBST 中摇洗 3 次，每次 5 分钟。
封片
1. 抗荧光淬灭封片剂封片。
2. 干燥玻片，将玻片置于室温下避光过夜。
3. 将载玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
| PSMC2 Antibody (Mouse mAb) [A15H16] 可检测内源性 PSMC2 总蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
|---|
| 细胞质，蛋白酶体 |
| Uniprot ID |
|---|
| P35998 |
| 克隆号 |
|---|
| A15H16 |
| 别名 |
|---|
| 26S proteasome regulatory subunit 7, 26S proteasome AAA-ATPase subunit RPT1, Proteasome 26S subunit ATPase 2, PSMC2, MSS1 |
| 背景 |
|---|
| PSMC2，也称为26S蛋白酶体调节亚基7或Rpt1，是19S调节颗粒基部的AAA-ATPase，是异源六聚体ATPase环的组成部分，负责底物结合、展开和转运至26S蛋白酶体的20S蛋白水解核心。该蛋白属于P环NTPase的AAA家族，其ATP结合和水解基序驱动基部构象变化。PSMC2与其他五个ATPase亚基和相邻的非ATPase支架共同形成底物加工通道，该通道识别多聚泛素标记的蛋白质，将其展开，并将其导入催化腔进行肽键断裂。在19S亚基中，PSMC2与其他ATPase亚基（如PSMC1和PSMC4）以及非ATPase亚基（如PSMD5）结合，支持调节颗粒的组装和稳定性，并促进其与20S核心的对接，从而确保泛素识别、去泛素化、蛋白质展开和蛋白水解之间的高效偶联。在多种组织中均检测到PSMC2的表达，这些组织需要组成型蛋白酶体活性来清除错误折叠或受损的蛋白质，通过及时降解调节因子来终止信号传导，并生成用于MHC I类抗原呈递的肽段。因此，作为核心泛素-蛋白酶体系统的一部分，该ATPase与细胞周期调控、细胞凋亡、DNA损伤反应和免疫监视密切相关。 PSMC2在肿瘤生物学中展现出依赖于特定情境的调控功能：在乳腺癌中，PSMC2过表达促进细胞增殖、克隆形成、迁移和肿瘤生长；机制分析表明，PSMC2与尿激酶型纤溶酶原激活剂（PLAU）相互作用，增强其蛋白丰度，从而支持纤溶酶原激活、基质重塑以及下游信号通路，促进肿瘤进展。PSMC2表达上调并与晚期临床病理特征相关；功能研究表明，PSMC2通过调控hsa-let-7c-3p增加核糖体蛋白S15A的表达，从而激活mTOR通路，这表明该ATPase在此背景下将蛋白酶体功能与翻译调控和生长信号通路联系起来。 |
| 参考文献 |
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