PSME1 Antibody (Rabbit mAb) [G15C24]
目录号: F6605
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: 293T, Lane 2: MCF7, Lane 3: Jurkat
操作要点
WB
湿转参考条件：200 mA, 60 min。
湿转参考条件：200 mA, 60 min。
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB, IF, ELISA |
| 反应性 |
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| Human |
| 抗体类型 |
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| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
实际分子量
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29 kDa
29 kDa
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| *为什么预测分子量和实际分子量会有不同？ 以下原因可能会导致蛋白分子量与预测不同：翻译后修饰（磷酸化/糖基化）；剪接变体和异构体；相对电荷；多聚体。 |
| 阳性对照 | HEK-293T cells; MCF7 cells; Jurkat cells |
|---|---|
| 阴性对照 |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 60 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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| IF |
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实验步骤：
样品准备
1. 贴壁细胞：取洁净无菌盖玻片置于培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片。
2. 悬浮细胞：将细胞接种至多聚赖氨酸包被的洁净无菌载玻片上。
3. 冰冻切片：将玻片置于室温下解冻，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。
4. 石蜡切片：先将玻片脱蜡至水，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。然后进行抗原修复。
固定
1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室温固定细胞爬片/涂片或组织切片 10~15 min。
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
通透
1. 对样品添加去垢剂，如 0.1~0.3% Triton X-100，室温通透 10~20 min。
（仅针对胞内抗原，若是细胞膜上表达的抗原则可省略该步骤。）
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
封闭
添加封闭液，在室温下封闭至少 1 h。（常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或山羊血清。）
注意事项：从封闭开始之后的所有步骤务必保证样品湿润，避免干燥，否则极易产生高背景。
免疫荧光染色（第一天）
1. 吸走封闭液，滴加稀释后的一抗。
2. 湿盒中 4°C 孵育过夜。
免疫荧光染色（第二天）
1. 吸走一抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
2. 滴加稀释后的荧光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。
3. 吸走二抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
4. 滴加稀释后的 DAPI，室温避光 孵育 5~10 min。
5. PBST 中摇洗 3 次，每次 5 分钟。
封片
1. 抗荧光淬灭封片剂封片。
2. 干燥玻片，将玻片置于室温下避光过夜。
3. 将载玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
| PSME1 Antibody (Rabbit mAb) [G15C24] 可检测内源性 PSME1 总蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
|---|
| 蛋白酶体 |
| Uniprot ID |
|---|
| Q06323 |
| 克隆号 |
|---|
| G15C24 |
| 别名 |
|---|
| IFI5111, PSME1, Proteasome activator 28 subunit alpha, REG-alpha, IGUP I-5111, PA28a, PA28alpha |
| 背景 |
|---|
| 蛋白酶体激活亚基1（PSME1，也称PA28α）是11S蛋白酶体激活复合物的一种干扰素-γ诱导型调节蛋白，它结合20S蛋白酶体核心的末端，并调节用于MHC I类抗原呈递的肽段生成。PA28α与同源亚基PA28β组装形成异源寡聚环，该环覆盖20S核心颗粒，打开轴向通道，并改变蛋白酶体的切割模式，使其产生末端适于加载到MHC I类分子上的肽段，这与组成型26S蛋白酶体及其19S调节颗粒产生的肽段不同。干扰素-γ上调抗原呈递细胞中PA28α/PSME1的表达，并促进PA28整合到免疫蛋白酶体中。免疫蛋白酶体还含有可诱导的催化亚基，例如PSMB8、PSMB9和PSMB10，从而形成一种专门的蛋白水解复合物，该复合物优化了从内源性和外源性蛋白质生成抗原表位的能力。含有PA28α的蛋白酶体增强了特定病毒表位的加工；PA28选择性地增加特定病毒MHC I类肽的呈递，而肿瘤细胞中PA28的下调会损害肿瘤相关抗原（例如TRP2）的呈递，这表明PSME1依赖的20S核心激活直接影响肽呈递给细胞毒性T淋巴细胞的种类和效率。小鼠体内PA28β基因的敲除导致PA28α和PA28β多肽的缺失，并显著抑制免疫蛋白酶体的组装，进而导致表位加工异常和细胞毒性T细胞反应受损。这表明PA28α/β复合物对于高效的抗原加工和正常的适应性免疫功能至关重要。结构和生化分析表明，PA28α/β通过多个接触位点与蛋白酶体α环结合，诱导构象变化打开蛋白酶体的“闸门”，并在不依赖泛素或ATP的情况下促进肽产物的通量增加。这表明PSME1活性与不依赖泛素的蛋白酶体降解以及肽长度和序列组成的精细调控密切相关。在多种癌症中，PSME1 和其他免疫蛋白酶体组分的表达与免疫细胞浸润和抗肿瘤免疫通路的激活密切相关。在非小细胞肺癌和三阴性乳腺癌中，高水平的免疫蛋白酶体亚基和干扰素诱导调节因子（如 PA28β）与 MHC I 类分子表达增加和肿瘤浸润淋巴细胞增多相关；而免疫蛋白酶体活性的抑制则会导致转移性病灶的免疫逃逸。因此，PSME1 作为关键的调节亚基，将干扰素-γ 信号通路和免疫蛋白酶体组装与 MHC I 类分子通路所供应肽的质量和数量联系起来。其表达状态有助于了解抗原加工能力、T 细胞反应性以及蛋白酶体靶向疗法在免疫相关疾病和癌症中的潜在作用。 |
| 参考文献 |
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