PTPN14 Antibody (Rabbit mAb) [H23F7]
目录号: F9610
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: ACHN, Lane 2: MDA-MB-231, Lane 3: HT-1080
操作要点
WB
建议 SDS-PAGE 分离胶浓度：5%。
建议 SDS-PAGE 分离胶浓度：5%。
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
|---|
| WB |
| 反应性 |
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| Human, Mouse, Rat |
| 抗体类型 |
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| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
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160 kDa
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| 阳性对照 | U-138 MG cells; ACHN cells; MDA-MB-231 cells |
|---|---|
| 阴性对照 | HT-1080 cells |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
| PTPN14 Antibody (Rabbit mAb) [H23F7] 可检测内源性 PTPN14 总蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
|---|
| 细胞膜，细胞质，内膜系统 |
| Uniprot ID |
|---|
| Q15678 |
| 克隆号 |
|---|
| H23F7 |
| 别名 |
|---|
| CATLPH; cytoskeletal-associated protein tyrosine phosphatase; MGC126803; PEZ; non-receptor type 14; Protein-tyrosine phosphatase pez; PTN14; PTP36; PTPD2; PTPN14 |
| 背景 |
|---|
| PTPN14（酪氨酸蛋白磷酸酶非受体型14；Pez/PTPD2/PTP36）是一种胞质非受体蛋白酪氨酸磷酸酶，属于4.1/FERM结构域亚家族，它通过直接调控Hippo效应蛋白YAP1和黏附相关底物，整合细胞间接触、细胞骨架组织和生长控制。该蛋白包含一个与4.1/ezrin/radixin/moesin相关的N端FERM结构域，该结构域将PTPN14锚定于质膜和皮质肌动蛋白网络；其后是延伸的低复杂度连接区，该连接区含有串联的PPXY (PY)基序，介导与WW结构域蛋白的结合；以及一个C端经典的PTP催化结构域，该结构域决定了PTPN14的磷酸酶活性，但对于其一些关键的支架功能并非必需。 PTPN14 通过其两个 PY 基序与 YAP1 直接结合，这两个 PY 基序分别与 YAP1 的两个 WW 结构域结合，其中第二个 WW 结构域对这种相互作用起主导作用；这种结合在细胞密度较高的情况下将 YAP1 从细胞核转移到细胞质中，仅间接地通过上游 LATS 激酶降低 YAP1 在 Ser127 位的磷酸化，并抑制 YAP1 对增殖和抗凋亡靶点（如 CTGF 和 AREG）的转录共激活活性，从而增强接触抑制并限制乳腺上皮 3D 培养中的腺泡生长。与 YAP1 的相互作用以及驱动其从细胞核到细胞质的转位的能力依赖于完整的 PY 基序和物理复合物的形成，但不需要 PTPN14 的催化活性，因为 Cys1121Ser 磷酸酶失活突变体保留了将 YAP1 隔离在细胞质中并挽救由 PTPN14 缺失引起的异常腺泡形成的能力，而 PY 基序缺失突变体则无法结合 YAP1，不能纠正 YAP1 的核积累，也不能恢复正常的腺泡结构。 PTPN14 水平及其对 YAP1 的抑制作用受细胞密度通过 CRL2^LRR1^ E3 泛素连接酶复合物进行翻译后调控：在低密度下，含有 LRR1 的 CRL2 结合 PTPN14，促进其多聚泛素化和蛋白酶体降解，维持较低的 PTPN14 丰度，同时 YAP1 主要位于细胞核内，并具有较高的增殖潜能；在汇合时，LRR1 表达降低，PTPN14 泛素化和周转减少，PTPN14 积累，YAP1 滞留在细胞质中，其方式与经典的 Hippo 激酶-14-3-3 依赖性隔离类似，但机制不同。 PTPN14 也定位于黏附连接和皮质肌动蛋白，其 FERM 结构域支持与 E-钙黏蛋白/β-连环蛋白复合物的结合。在内皮细胞中，PTPN14 介导黏附连接处 β-连环蛋白的去磷酸化，从而稳定 E-钙黏蛋白-β-连环蛋白的连接，并有助于维持屏障完整性和调节细胞运动。此外，PTPN14 与 VEGFR3 的相互作用以及在淋巴管生成中的作用，使其与血管和淋巴管的发育密切相关。在非转化乳腺上皮细胞中，通过 shRNA 敲低 PTPN14 会导致细胞发生锚定非依赖性生长，破坏极化腺泡结构，导致过度增殖和多腺泡结构形成。而同时敲低 YAP1 则可逆转这些致癌表型，表明 YAP1 是 PTPN14 抑癌活性的关键下游效应因子。 |
| 参考文献 |
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