Puromycin Antibody (Rabbit mAb) [H12G14]
目录号: F6534
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: Hela, Lane 2: Hela (Puromycin, 1uM, 30 min), Lane 3: NIH/3T3, Lane 4: NIH/3T3 Hela (Puromycin, 1uM, 30 min)
操作要点
WB
建议 SDS-PAGE 分离胶浓度：5%。
湿转参考条件：250 mA, 180 min。
建议 SDS-PAGE 分离胶浓度：5%。
湿转参考条件：250 mA, 180 min。
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB, IP, IHC, IF, FCM |
| 反应性 |
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| Chemical |
| 抗体类型 |
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| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
|---|
| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
| 阳性对照 | HeLa cells (Puromycin, 1uM, 30 min); NIH/3T3 cells (Puromycin, 1uM, 30 min); C6 cells (Puromycin, 1uM, 30 min) |
|---|---|
| 阴性对照 | Rat kidney tissue; Mouse kidney tissue; Human kidney tissue; NIH/3T3 cells; C6 cells; HeLa cells |
实验方法
| WB |
|---|
实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的组织裂解液（含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的细胞裂解液（含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的细胞裂解液（含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。 PVDF 膜孔径规格选择参照表
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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| IF |
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实验步骤：
样品准备
1. 贴壁细胞：取洁净无菌盖玻片置于培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片。
2. 悬浮细胞：将细胞接种至多聚赖氨酸包被的洁净无菌载玻片上。
3. 冰冻切片：将玻片置于室温下解冻，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。
4. 石蜡切片：先将玻片脱蜡至水，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。然后进行抗原修复。
固定
1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室温固定细胞爬片/涂片或组织切片 10~15 min。
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
通透
1. 对样品添加去垢剂，如 0.1~0.3% Triton X-100，室温通透 10~20 min。
（仅针对胞内抗原，若是细胞膜上表达的抗原则可省略该步骤。）
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
封闭
添加封闭液，在室温下封闭至少 1 h。（常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或山羊血清。）
注意事项：从封闭开始之后的所有步骤务必保证样品湿润，避免干燥，否则极易产生高背景。
免疫荧光染色（第一天）
1. 吸走封闭液，滴加稀释后的一抗。
2. 湿盒中 4°C 孵育过夜。
免疫荧光染色（第二天）
1. 吸走一抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
2. 滴加稀释后的荧光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。
3. 吸走二抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
4. 滴加稀释后的 DAPI，室温避光 孵育 5~10 min。
5. PBST 中摇洗 3 次，每次 5 分钟。
封片
1. 抗荧光淬灭封片剂封片。
2. 干燥玻片，将玻片置于室温下避光过夜。
3. 将载玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。
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| IHC |
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实验步骤：
脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片：
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
| Puromycin Antibody (Rabbit mAb) [H12G14] 可检测外源性 Puromycin 总水平。 |
| 克隆号 |
|---|
| H12G14 |
| 别名 |
|---|
| Puromycin-sensitive aminopeptidase, PSA, Cytosol alanyl aminopeptidase (AAP-S), NPEPPS, PSA |
| 背景 |
|---|
| 嘌呤霉素是一种天然存在的氨基核苷类抗生素，来源于链霉菌（Streptomyces alboniger）。它是一种小分子，模拟氨酰-tRNA的3′末端，通过直接与原核细胞和真核细胞中的核糖体延伸机制相互作用，发挥强效的通用翻译抑制剂作用。该分子由一个腺苷样核苷通过其核糖3′位点与一个酪氨酸样氨基酸部分共价连接而成，形成带电tRNA 3′-CCA末端的结构类似物。其中，tRNA与氨基酸之间的天然酯键被不可水解的酰胺键取代，从而抵抗肽酰-tRNA的水解，这正是其链终止活性的基础。嘌呤霉素与氨酰-tRNA竞争进入核糖体A位点，将其氨基对准肽酰转移酶中心，并从P位点肽酰-tRNA接受正在生长的多肽，形成肽酰-嘌呤霉素缀合物；所得产物缺乏tRNA部分，无法稳定地锚定在核糖体上，导致截短的肽酰-嘌呤霉素从P位点解离，蛋白质合成过早终止，而核糖体则保持完整的70S（或80S）单体，可以作为一个整体从mRNA上脱落，而不是像正常终止时那样解离成亚基。这种机制使嘌呤霉素成为一种延伸阶段抑制剂，它不需要特定的起始环境，因此可以掺入任何正在翻译的核糖体上的新生肽链中，并产生一群在其C端共价连接该抗生素的嘌呤霉素化新生肽链。分子生物学广泛利用这一特性，通过SUnSET和核糖体谱分析等方法标记和定量新生蛋白质合成。嘌呤霉素的核糖体催化掺入遵循与两个tRNA之间肽基转移相同的化学原理，其有效性源于细菌和真核生物中肽基转移酶中心和A位点的保守结构，这使得即使核糖体蛋白组成存在差异，也能实现广谱抑制。该抗生素通过占据A位点并将正在延伸的肽链从其tRNA载体上移除，阻断了肽链的进一步延伸循环，导致后续的EF-Tu/eEF1A依赖性氨酰tRNA递送无效，整体翻译水平迅速下降，细胞经历蛋白质稳态应激，激活整合应激反应、未折叠蛋白反应，并在高浓度或长时间暴露的情况下激活细胞凋亡和坏死途径。嘌呤霉素也可用作哺乳动物细胞培养中的强效筛选试剂，其中细菌嘌呤霉素N-乙酰转移酶（pac）基因的共表达通过酶促乙酰化嘌呤霉素上的氨基赋予细胞抗性，从而阻止其参与肽酰转移，并使转染细胞在持续的抗生素压力下存活。 |
| 参考文献 |
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