Pyrin Antibody (Rabbit mAb) [L17B15]
目录号: F2811
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: Bone marrow derived-macrophage of WT C57/B6 mice
操作要点
WB
建议曝光 120s 以上。
建议曝光 120s 以上。
使用信息
| 稀释比例 |
|---|
|
| 抗体应用 |
|---|
| WB, IP |
| 反应性 |
|---|
| Mouse |
| 抗体类型 |
|---|
| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
|---|
| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
|---|
| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
|
预测分子量
实际分子量
|
|---|
|
86 kDa
110 kDa
|
| *为什么预测分子量和实际分子量会有不同？ 以下原因可能会导致蛋白分子量与预测不同：翻译后修饰（磷酸化/糖基化）；剪接变体和异构体；相对电荷；多聚体。 |
| 阳性对照 | Bone marrow derived-macrophage of wild type C57/B6 mice (LPS, stimulated); Bone marrow derived-macrophage of wild type C57/B6 mice (TNFα, stimulated); DC2.4 cells |
|---|---|
| 阴性对照 |
实验方法
| WB |
|---|
实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。 (建议曝光时长 120s 以上)
|
生物描述
| 特异性 |
|---|
| Pyrin Antibody (Rabbit mAb) [L17B15] 可检测内源性 Pyrin 总蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
|---|
| 细胞突起，细胞质，胞质囊泡，细胞骨架，微管，细胞核 |
| Uniprot ID |
|---|
| O15553 |
| 克隆号 |
|---|
| L17B15 |
| 别名 |
|---|
| MEF, TRIM20, MEFV, Pyrin, Marenostrin |
| 背景 |
|---|
| Pyrin是一种由MEFV基因编码的固有免疫传感器，属于TRIM家族。它作为胞质模式识别受体发挥作用，在细胞骨架和Rho GTP酶依赖性稳态发生特定紊乱时，而非直接结合微生物配体，组装成炎症小体。该蛋白包含一个N端pyrin结构域，介导与衔接蛋白ASC的同型相互作用；一个中央B-box和卷曲螺旋区域，支持更高级的组装以及与细胞骨架和调控伙伴的结合；以及一个C端B30.2/SPRY结构域，参与感知上游调控变化，并赋予激活阈值等位基因特异性效应。在静息状态下，RhoA GTP酶及其下游激酶PKN1和PKN2磷酸化pyrin的特定丝氨酸残基，形成14-3-3蛋白的结合位点，使pyrin保持非活性状态。因此，即使存在MEFV，完整的RhoA信号通路也能抑制pyrin炎症小体的激活。细菌毒素和效应因子通过抑制RhoA的活性或干扰其信号通路，解除这种抑制，其机制是通过阻止pyrin的磷酸化和14-3-3蛋白的结合，从而允许pyrin寡聚化，并通过pyrin-PYD与ASC-PYD的相互作用募集ASC，进而募集并激活pro-caspase-1。活化的 caspase-1 将 pro-IL-1β 和 pro-IL-18 裂解为成熟形式，并加工 gasdermin D 以驱动细胞焦亡，从而将病原体诱导的 RhoA 失活与关键促炎细胞因子的快速释放以及感染细胞的裂解清除联系起来。Pyrin 在中性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞中高表达，有助于宿主防御靶向 Rho GTP 酶的病原体，Pyrin 依赖性炎症小体的激活可降低细菌载量，并在肺部、肠道和全身感染模型中调节炎症反应。 MEFV 中的错义突变和截断突变，特别是 B30.2 结构域内的突变，会降低激活阈值或破坏 pyrin 的负调控，导致组成型或过度炎症小体组装、caspase-1 活性增加以及 IL-1β/IL-18 过度产生，这些都是家族性地中海热和其他与 pyrin 相关的自身炎症性疾病的基础。 |
| 参考文献 |
|---|
|
技术支持
在订购、运输、储存和使用我们的产品的任何阶段，您遇到的任何问题，均可以通过拨打我们的热线电话400-668-6834，或者技术支持邮箱tech@selleck.cn，直接联系到我们。我们会在24小时内尽快联系您。
* 必填项
