PZR Antibody (Rabbit mAb) [F15F10]
目录号: F5912
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: 293T, Lane 2: PANC1, Lane 3: LNCAP, Lane 4: U2OS -
Immunofluorescent analysis of HUVEC cells using F5912 (green, 1:50), Hoechst (blue) and tubulin (Red).
操作要点
WB
湿转参考条件：200 mA, 60 min。
湿转参考条件：200 mA, 60 min。
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB, IP, IF |
| 反应性 |
|---|
| Human |
| 抗体类型 |
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| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
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30-50 kDa
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| 阳性对照 | HUVEC cells; MCF7 cells; Hep G2 cells; 293T cells; PANC-1 cells; HT-1080 cells; LNCaP cells; U-2-0S cells |
|---|---|
| 阴性对照 |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 在 20 μL 样品中加入蛋白上样缓冲液，可直接冰上备用；或通过温度梯度（如37 ℃煮样、50 ℃煮样、70 ℃煮样、90 ℃煮样、100 ℃煮样）来确定最佳变性条件，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 60 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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| IF |
|---|
实验步骤：
样品准备
1. 贴壁细胞：取洁净无菌盖玻片置于培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片。
2. 悬浮细胞：将细胞接种至多聚赖氨酸包被的洁净无菌载玻片上。
3. 冰冻切片：将玻片置于室温下解冻，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。
4. 石蜡切片：先将玻片脱蜡至水，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。然后进行抗原修复。
固定
1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室温固定细胞爬片/涂片或组织切片 10~15 min。
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
封闭
添加封闭液，在室温下封闭至少 1 h。（常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或山羊血清。）
注意事项：从封闭开始之后的所有步骤务必保证样品湿润，避免干燥，否则极易产生高背景。
免疫荧光染色（第一天）
1. 吸走封闭液，滴加稀释后的一抗。
2. 湿盒中 4°C 孵育过夜。
免疫荧光染色（第二天）
1. 吸走一抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
2. 滴加稀释后的荧光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。
3. 吸走二抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
4. 滴加稀释后的 DAPI，室温避光 孵育 5~10 min。
5. PBST 中摇洗 3 次，每次 5 分钟。
封片
1. 抗荧光淬灭封片剂封片。
2. 干燥玻片，将玻片置于室温下避光过夜。
3. 将载玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
| PZR Antibody (Rabbit mAb) [F15F10] 可检测内源性 PZR 总蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
|---|
| 内膜系统 |
| Uniprot ID |
|---|
| O95297 |
| 克隆号 |
|---|
| F15F10 |
| 别名 |
|---|
| Myelin protein zero-like protein 1, Protein zero-related, MPZL1, PZR |
| 背景 |
|---|
| PZR（零蛋白相关蛋白，MPZL1）是一种I型跨膜糖蛋白，属于免疫球蛋白超家族，定位于细胞间接触和迁移相关结构的质膜上，并作为信号支架，将细胞外信号与Src和SHP-2依赖性通路连接起来。其胞外区含有N-糖基化的Ig样结构域，可与凝集素伴刀豆球蛋白A（ConA）结合；而全长亚型的短胞质尾部包含一对串联的免疫受体酪氨酸基抑制基序，其中的酪氨酸可被包括c-Src在内的Src家族激酶磷酸化。 PZR 与 c-Src 组成性结合，ConA 与该糖蛋白结合后，会触发 ITIM 酪氨酸的强烈磷酸化，增强 c-Src 的激活，并募集含有 SH2 结构域的磷酸酶 SHP-2。这种相互作用可被 Src 抑制剂（如 PP1）阻断，并在 PZR 胞质尾截短时被破坏。这些分子事件表明 PZR 是 ConA 诱导信号传导的主要受体，其中 Src 激活和 SHP-2 与磷酸化 ITIM 的结合共同调节下游信号通路，进而影响细胞骨架组织、细胞形态和细胞凝集反应。 MPZL1转录本的选择性剪接产生缺乏ITIM基序的异构体PZRa和PZRb。这些变体保留了胞外区和跨膜区，但在与SHP-2偶联以及转导Src依赖性抑制或调节信号的能力上存在差异。PZR在心血管、肾脏和胰腺组织中富集，并集中于内皮细胞间连接处。其黏附和信号传导特性与SHP-2依赖性内皮屏障功能和细胞间接触组织的调节有关。在SHP-2激活或失调的遗传模型中，包括与努南综合征和LEOPARD综合征相关的PTPN11变体，均检测到PZR酪氨酸磷酸化水平升高。这种磷酸化与受累组织中SHP-2膜募集增强以及生长和分化信号传导改变相关。据报道，MPZL1 扩增和 PZR 过表达存在于多种肿瘤类型中，其中 PZR 信号增强与 c-Src 活性升高、SHP-2 参与增加以及细胞迁移和侵袭行为增强有关，从而将这种受体样接头与肝细胞癌和其他癌症的转移程序和疾病进展联系起来。 |
| 参考文献 |
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