Rab11A Antibody (Rabbit mAb) [N14G1]
目录号: F9796
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: A431, Lane 2: C6, Lane 3: Mouse brain, Lane 4: Rat brain
操作要点
WB
湿转参考条件：200 mA, 60 min。
湿转参考条件：200 mA, 60 min。
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB, IF |
| 反应性 |
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| Human, Mouse, Rat |
| 抗体类型 |
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| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
实际分子量
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24 kDa
24 kDa,36 kDa
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| *为什么预测分子量和实际分子量会有不同？ 以下原因可能会导致蛋白分子量与预测不同：翻译后修饰（磷酸化/糖基化）；剪接变体和异构体；相对电荷；多聚体。 |
| 阳性对照 | Human brain tissue; Mouse brain tissue; Mouse spleen tissue; Rat brain tissue; Rat spleen tissue; A431 cells; C6 cells; A549 cells; HeLa cells; HCT 116 cells; LNCaP cells; Neuro-2a cells; 4T1 cells; EL4 cells; Jurkat cells |
|---|---|
| 阴性对照 |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 60 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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| IF |
|---|
实验步骤：
样品准备
1. 贴壁细胞：取洁净无菌盖玻片置于培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片。
2. 悬浮细胞：将细胞接种至多聚赖氨酸包被的洁净无菌载玻片上。
3. 冰冻切片：将玻片置于室温下解冻，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。
4. 石蜡切片：先将玻片脱蜡至水，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。然后进行抗原修复。
固定
1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室温固定细胞爬片/涂片或组织切片 10~15 min。
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
通透
1. 对样品添加去垢剂，如 0.1~0.3% Triton X-100，室温通透 10~20 min。
（仅针对胞内抗原，若是细胞膜上表达的抗原则可省略该步骤。）
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
封闭
添加封闭液，在室温下封闭至少 1 h。（常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或山羊血清。）
注意事项：从封闭开始之后的所有步骤务必保证样品湿润，避免干燥，否则极易产生高背景。
免疫荧光染色（第一天）
1. 吸走封闭液，滴加稀释后的一抗。
2. 湿盒中 4°C 孵育过夜。
免疫荧光染色（第二天）
1. 吸走一抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
2. 滴加稀释后的荧光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。
3. 吸走二抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
4. 滴加稀释后的 DAPI，室温避光 孵育 5~10 min。
5. PBST 中摇洗 3 次，每次 5 分钟。
封片
1. 抗荧光淬灭封片剂封片。
2. 干燥玻片，将玻片置于室温下避光过夜。
3. 将载玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
| Rab11A Antibody (Rabbit mAb) [N14G1] 可检测内源性 Rab11A 总蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
|---|
| 细胞膜，细胞突起，胞质囊泡，内体，高尔基体，内膜系统 |
| Uniprot ID |
|---|
| P62491 |
| 克隆号 |
|---|
| N14G1 |
| 别名 |
|---|
| RAB11, RAB11A, Ras-related protein Rab-11A, Rab-11, YL8 |
| 背景 |
|---|
| Rab11A属于Ras超家族中的Rab11亚家族，该亚家族包含小GTP酶，与密切相关的同源异构体Rab11B和Rab25同属一类。与其他Rab蛋白一样，Rab11A通过C端异戊二烯化锚定于膜上，并在活性GTP结合构象和非活性GDP结合构象之间循环。这种核苷酸依赖性开关的结构核心是两个可移动区域，即开关1和开关2。这两个区域的构象会根据所结合的核苷酸种类而发生显著变化，它们共同构成下游效应蛋白识别的主要表面。Rab11A定位于循环内体、反式高尔基网络和高尔基后囊泡。一旦结合GTP，Rab11A便会通过其高度保守的羧基末端Rab结合域募集一类特定的效应蛋白——Rab11家族相互作用蛋白（FIPs）。该FIPs家族成员共有该结合域。对活性 GTP 结合的 Rab11A 与 FIP2 的 Rab 结合域复合物的晶体结构分析表明，FIP2 结构域形成一个中央 α 螺旋卷曲螺旋，该卷曲螺旋同源二聚化形成两个对称的结合界面，从而产生两个 FIP 分子与两个 Rab11 分子结合的异源四聚体组装体，而不是简单的 1:1 复合物；在每个界面中，Rab11 的开关 1 区直接嵌入两个 FIP2 螺旋之间，而更灵活的开关 2 区仅与效应物进行外围接触，表明开关 1 为 FIP 识别提供了主要的、结构刚性的锚点。根据Rab结合域两侧的附加结构域，FIP蛋白可分为结构和功能不同的两类：I类FIP蛋白，包括Rip11和FIP2，其N端带有C2或EF手结构域，赋予其对钙和磷脂的敏感性，并将大部分循环货物引导至富含磷脂的质膜上的停靠位点；而II类FIP蛋白，包括FIP3和FIP4，则结合GTP酶Arf6，并在胞质分裂过程中被募集到分裂沟和中体，为细胞分裂提供内体膜物质。通过这些FIP效应蛋白，Rab11A还能与肌球蛋白V、驱动蛋白和动力蛋白等运动蛋白偶联，使GTP酶Arf6成为连接载有货物的循环内体和细胞骨架运输机制的组织枢纽，从而将转铁蛋白受体和整合素等受体运送回质膜。 |
| 参考文献 |
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