Ras (G12D Mutant) Antibody (Rabbit mAb) [C11A12]
目录号: F6955
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: PANC1, Lane 2: AsPC1
操作要点
WB
湿转参考条件：200 mA, 60 min。
湿转参考条件：200 mA, 60 min。
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB, IHC |
| 反应性 |
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| Human, Mouse |
| 抗体类型 |
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| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
实际分子量
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21 kDa
22 kDa
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| *为什么预测分子量和实际分子量会有不同？ 以下原因可能会导致蛋白分子量与预测不同：翻译后修饰（磷酸化/糖基化）；剪接变体和异构体；相对电荷；多聚体。 |
| 阳性对照 | Mouse pancreatic tumor cells; Human KRAS G12D mutant pancreatic tumor; AaPC-1 (KFRAS G12D); PANC-1 (KRAS G12D); HPAC(KRAS G12D); HPAF-1(KRAS G12D); SU66.86 (KRAS G12D) |
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| 阴性对照 | Normal human pancreas; Normal mouse pancreas; HPDE cells; CFPAC-1(KRAS G12V); HPNE; BaPC3 (KRAS WT); CFPAC1(KRAS G12D); MA PaCa-2 (KRAS G12C) |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 60 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:500），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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| IHC |
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实验步骤：
脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片：
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
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生物描述
| 特异性 |
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| Ras (G12D Mutant) Antibody (Rabbit mAb) [C11A12] 可检测内源性 Ras (G12D Mutant) 总蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
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| 细胞膜，细胞质，内膜系统 |
| Uniprot ID |
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| P01116 |
| 克隆号 |
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| C11A12 |
| 别名 |
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| GTPase Kras, K-Ras 2, Ki-Ras, c-K-ras, c-Ki-ras, KRAS, KRAS2, RASK2 |
| 背景 |
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| Ras G12D 是小 GTP 酶 K-Ras 的一种致癌突变体，K-Ras 是 RAS 家族的成员，该家族是一类鸟嘌呤核苷酸结合开关，调控受体酪氨酸激酶和其他上游信号下游的促有丝分裂和存活信号通路。该突变将 G 结构域 P 环第 12 位的甘氨酸替换为天冬氨酸，该位点紧邻核苷酸和催化机制，并改变了局部侧链堆积、氢键和静电环境，导致催化位点构象发生变化，在 GTP 酶激活蛋白存在的情况下，无法有效水解 GTP。突变蛋白保留了典型的RAS折叠结构，包含一个结合GTP或GDP的G结构域以及一个介导效应物识别的柔性开关I区和开关II区。然而，G12D突变增加了活性状态构象的占据率，并破坏了过渡态稳定所需的关键接触，从而稳定了GTP结合的信号传导活性形式，并降低了对GAP催化失活的响应。激活的G12D突变体通过RAS结合域与Raf激酶结合，启动Raf-MEK-ERK级联反应，驱动增殖和存活的转录程序；同时，它通过直接相互作用与PI3K偶联，支持促进细胞生长和存活的PI3K-AKT轴。响应RAS G12D的其他效应通路包括Ral鸟嘌呤核苷酸交换因子和其他下游节点，这些通路提供多个相互增强的平行输出，以维持增殖和抗凋亡状态。 K-Ras G12D复合物的结构分析表明，12位天冬氨酸侧链在GTP的γ-磷酸基团和GAP的精氨酸指附近引入了空间位阻和静电冲突，这解释了其催化几何构型受损的原因。尽管如此，该蛋白仍保持了对GTP和GDP的高亲和力，导致其难以循环回到GDP结合的非活性状态，并积累在能够结合效应分子的激活状态。这种突变信号传导行为维持了MAPK和PI3K通路的慢性激活，从而增加了细胞周期启动、对凋亡信号的抵抗力以及分化模式的改变，并使KRAS G12D成为RAS通路调控上皮稳态的组织中肿瘤发生的主要驱动因素。致癌 K-Ras G12D 的内源性表达通过 Raf-MEK-ERK 和 PI3K-AKT 级联的联合输入刺激上皮细胞增殖并扩增祖细胞区室，而无需额外的上游受体过度激活，这一特性使突变体与依赖于严格调控的生长因子信号的野生型 RAS 区分开来。 |
| 参考文献 |
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