Sall4 Antibody (Mouse mAb) [D8D9]
目录号: F5817
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: mESC
操作要点
WB
建议 SDS-PAGE 分离胶浓度：5%。
建议 SDS-PAGE 分离胶浓度：5%。
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB, IHC, FCM |
| 反应性 |
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| Human |
| 抗体类型 |
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| Mouse Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
实际分子量
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112 kDa
140 kDa
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| *为什么预测分子量和实际分子量会有不同？ 以下原因可能会导致蛋白分子量与预测不同：翻译后修饰（磷酸化/糖基化）；剪接变体和异构体；相对电荷；多聚体。 |
| 阳性对照 | Adult mouse testis tissue; Human testis tissue; Juvenile (PND 7 and PND 14) mouse tissue; Adult marmoset testis tissue; HeLa cells; NCCIT cells; mESC cells |
|---|---|
| 阴性对照 | Mouse testis tissue; Human testis tissue; MEF cells; HuES7 cells; MCF7 cells |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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| IHC |
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实验步骤：
脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片：
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
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生物描述
| 特异性 |
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| Sall4 Antibody (Mouse mAb) [D8D9] 可检测内源性 Sall4 总蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
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| 细胞质，细胞核 |
| Uniprot ID |
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| Q9UJQ4 |
| 克隆号 |
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| D8D9 |
| 别名 |
|---|
| ZNF797, SALL4, Sal-like protein 4, Zinc finger protein 797, Zinc finger protein SALL4 |
| 背景 |
|---|
| SALL4是哺乳动物spalt家族的锌指转录因子，在干细胞转录网络中占据核心地位。它维持胚胎干细胞的多能性和自我更新能力，并通过调控遗传和表观遗传程序，支持造血干细胞和祖细胞的扩增和命运控制。该蛋白包含多个C2H2锌指簇，赋予其序列特异性的DNA结合能力；同时，其低复杂度区域介导与Nanog、Oct4、Sox2、DNA甲基转移酶和表观遗传复合物等辅助因子的相互作用。尽管核心结构框架相同，SALL4仍可通过不同的转录通路在不同的干细胞谱系中发挥作用。在胚胎干细胞中，SALL4结合Pou5f1高度保守的远端增强子并激活Oct4转录。SALL4水平降低会导致胚胎干细胞向滋养层细胞命运转变，并伴随Cdx2表达的增加，这表明SALL4作为Oct4的直接转录激活因子，对于维持胚胎干细胞的多能性状态和早期胚胎细胞命运决定至关重要。全基因组定位分析显示，SALL4与许多Nanog和Oct4的结合位点共定位，并调控大量多能性基因。谱系分析表明，SALL4在胚胎干细胞和胚外内胚层干细胞中调控不同的转录通路，强调了其作为一种多功能调控因子，能够根据囊胚来源的特定谱系调整其靶基因组合的作用。在正常造血过程中，SALL4 选择性地表达于原始 CD34+ 造血干细胞和祖细胞中，随着这些细胞的分化而迅速下调，并且在成熟的髓系细胞群中不存在。在小鼠 Lin−/Sca1+/c‑Kit+ LSK 细胞中强制表达 SALL4A 或 SALL4B 可驱动持续的体外增殖、功能性 HSC/HPC 池的扩增以及移植后增强的长期多系重建，而内源性 SALL4 的下调则降低 LSK 细胞的增殖并加速分化。这些干细胞增强活性伴随着关键造血干细胞/祖细胞调控因子（HSC/HPC）的显著上调，包括HoxB4、Notch1、Bmi-1、Runx1、Meis1和NF-YA，这使得SALL4处于转录调控层级的顶端，该层级能够促进髓系祖细胞的自我更新并抑制粒细胞分化，从而为利用SALL4调控策略大规模扩增临床可移植干细胞奠定了基础。在机制层面，SALL4通过结合DNA甲基转移酶并与其酶活性相互作用来调控表观遗传机制，过表达时增加整体DNA甲基化水平，并通过募集NuRD复合物抑制PTEN等靶基因的转录，同时激活Bmi-1并与Wnt/β-catenin信号通路相互作用，形成SALL4/Wnt/Bmi-1/PTEN网络，该网络整合了染色质修饰、干性和白血病转化。在急性髓系白血病和多种实体瘤中，SALL4 表达失调被重新激活；转基因小鼠中 SALL4 的组成性表达可诱发 AML；癌症研究表明，SALL4 通过对下游致癌通路进行遗传和表观遗传控制，驱动癌症干细胞的增殖、存活、化疗耐药性和维持，这使得 SALL4 成为一种强大的癌症生物标志物和新兴的治疗靶点。 |
| 参考文献 |
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