Siglec-1/CD169 Antibody (Mouse mAb) [E18B9]
目录号: F4341
抗体应用：
反应性：
-
Immunofluorescent analysis of Mouse small intestine tissue using F4341 (green, 1:500), Hoechst (blue) and tubulin (Red).
操作要点
WB
建议 SDS-PAGE 分离胶浓度：5%。
建议 SDS-PAGE 分离胶浓度：5%。
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
|---|
| WB, IHC, IF, FCM, ELISA |
| 反应性 |
|---|
| Human, Mouse, Porcine, Viru |
| 抗体类型 |
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| Mouse Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
|---|
| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
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183 kDa
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| 阳性对照 | Adult mouse small intestine; Human spleen; Human CD14 and PBMC differentiated to M1 macrophages with rhGM-CSF |
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| 阴性对照 |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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| IF |
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实验步骤：
样品准备
1. 贴壁细胞：取洁净无菌盖玻片置于培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片。
2. 悬浮细胞：将细胞接种至多聚赖氨酸包被的洁净无菌载玻片上。
3. 冰冻切片：将玻片置于室温下解冻，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。
4. 石蜡切片：先将玻片脱蜡至水，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。然后进行抗原修复。
固定
1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室温固定细胞爬片/涂片或组织切片 10~15 min。
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
通透
1. 对样品添加去垢剂，如 0.1~0.3% Triton X-100，室温通透 10~20 min。
（仅针对胞内抗原，若是细胞膜上表达的抗原则可省略该步骤。）
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
封闭
添加封闭液，在室温下封闭至少 1 h。（常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或山羊血清。）
注意事项：从封闭开始之后的所有步骤务必保证样品湿润，避免干燥，否则极易产生高背景。
免疫荧光染色（第一天）
1. 吸走封闭液，滴加稀释后的一抗。
2. 湿盒中 4°C 孵育过夜。
免疫荧光染色（第二天）
1. 吸走一抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
2. 滴加稀释后的荧光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。
3. 吸走二抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
4. 滴加稀释后的 DAPI，室温避光 孵育 5~10 min。
5. PBST 中摇洗 3 次，每次 5 分钟。
封片
1. 抗荧光淬灭封片剂封片。
2. 干燥玻片，将玻片置于室温下避光过夜。
3. 将载玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。
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| IHC |
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实验步骤：
脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片：
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
Siglec-1/CD169 Antibody (Mouse mAb) [E18B9] 可检测内源性 Siglec-1/CD169 总蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
|---|
| 细胞膜，内膜系统，细胞外环境 |
| Uniprot ID |
|---|
| Q9BZZ2 |
| 克隆号 |
|---|
| E18B9 |
| 别名 |
|---|
| CD169, FLJ00051, sialic acid binding Ig-like lectin 1, sialoadhesin, Siglec1, Siglec-1 |
| 背景 |
|---|
Siglec-1（CD169，唾液酸黏附素，SIGLEC1）是一种巨噬细胞特异性I型跨膜受体，属于唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素（Siglec）家族，能够识别α2,3连接的唾液酸化糖缀合物，并在髓系细胞、淋巴细胞和病原体之间的界面发挥关键的黏附和摄取作用。其胞外区包含一个N端V型免疫球蛋白结构域，该结构域含有保守的唾液酸结合位点，随后是一系列C2型免疫球蛋白结构域，这使得Siglec-1成为最大的Siglec，并使其能够深入血管或淋巴管腔。其短的胞内尾部缺乏典型的抑制性ITIM基序，但可以通过相关的衔接蛋白支持内吞作用和信号传导。 Siglec-1的表达主要局限于组织驻留巨噬细胞、边缘区巨噬细胞和干扰素诱导型髓系细胞的亚群。在这些细胞中，I型干扰素和炎症信号上调Siglec-1的表达，并定位于质膜结构域，该结构域可与红细胞、B细胞、CD8 T细胞、NK细胞、粒细胞和活化淋巴细胞上的唾液酸化配体结合，从而促进细胞间黏附、聚集和免疫突触的形成。配体结合驱动唾液酸依赖性的唾液酸化颗粒和病原体（包括包膜病毒和细菌）的捕获和内化。Siglec-1阳性巨噬细胞和树突状细胞利用该受体介导抗原的摄取、吞噬和转运至抗原呈递细胞，从而支持MHC II类分子和交叉呈递给T细胞，并使这些细胞能够将先天免疫识别与适应性免疫启动联系起来。在病毒感染的背景下，Siglec-1识别HIV-1和其他包膜病毒膜上的唾液酸化神经节苷脂，例如GM3，将病毒颗粒浓缩在非降解性隔室中，并通过称为跨感染的过程将其递送至CD4 T细胞，从而增强病毒的传播，而髓系细胞可能仍处于非生产性感染状态。同样的受体-糖脂机制也适用于其他几种包膜病毒，包括SARS-CoV-2。在这些病毒中，表达Siglec-1的巨噬细胞捕获病毒颗粒，调节细胞因子反应，并可能促进过度炎症反应，或者在某些情况下限制病毒传播并支持有效的T细胞反应，这凸显了该凝集素的双重作用：既保护宿主，又被病原体利用。Siglec-1阳性巨噬细胞也参与组织免疫调节；它们分布于脾脏和淋巴结边缘区以及炎症组织中，清除唾液酸化碎片和凋亡物质，并影响淋巴细胞增殖和免疫耐受。它们在类风湿性关节炎和多发性硬化症等自身免疫性疾病中的存在，与其在慢性炎症形成中的作用相符。血液单核细胞或组织巨噬细胞上CD169的表达可作为系统性红斑狼疮和病毒感染中敏感的干扰素反应生物标志物。CD169免疫组化广泛用于识别活化的髓系细胞亚群和绘制神经炎症灶，例如在活动性多发性硬化症斑块或其他中枢神经系统炎症性疾病中。这些特征将Siglec-1/CD169定义为一种结构独特的、唾液酸依赖性的黏附和内吞受体，它整合了I型干扰素信号传导、病原体捕获、抗原呈递以及髓系-淋巴系细胞间的相互作用。 |
| 参考文献 |
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