SMN Antibody (Rabbit mAb) [C8K16]
目录号: F8824
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: Hela, Lane 2: 293T, Lane 3: K562, Lane 4: U-87 MG
操作要点
WB
湿转参考条件：200 mA, 60 min。
湿转参考条件：200 mA, 60 min。
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB, IP, IF, FCM |
| 反应性 |
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| Human, Mouse |
| 抗体类型 |
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| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
实际分子量
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32 kDa
35 kDa
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| *为什么预测分子量和实际分子量会有不同？ 以下原因可能会导致蛋白分子量与预测不同：翻译后修饰（磷酸化/糖基化）；剪接变体和异构体；相对电荷；多聚体。 |
| 阳性对照 | HeLa cells; Neuro-2a cells; 293T cells; K-562 cells; U-87 MG cells; SH-SY5Y cells |
|---|---|
| 阴性对照 |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 60 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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| IF |
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实验步骤：
样品准备
1. 贴壁细胞：取洁净无菌盖玻片置于培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片。
2. 悬浮细胞：将细胞接种至多聚赖氨酸包被的洁净无菌载玻片上。
3. 冰冻切片：将玻片置于室温下解冻，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。
4. 石蜡切片：先将玻片脱蜡至水，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。然后进行抗原修复。
固定
1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室温固定细胞爬片/涂片或组织切片 10~15 min。
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
通透
1. 对样品添加去垢剂，如 0.1~0.3% Triton X-100，室温通透 10~20 min。
（仅针对胞内抗原，若是细胞膜上表达的抗原则可省略该步骤。）
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
封闭
添加封闭液，在室温下封闭至少 1 h。（常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或山羊血清。）
注意事项：从封闭开始之后的所有步骤务必保证样品湿润，避免干燥，否则极易产生高背景。
免疫荧光染色（第一天）
1. 吸走封闭液，滴加稀释后的一抗。
2. 湿盒中 4°C 孵育过夜。
免疫荧光染色（第二天）
1. 吸走一抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
2. 滴加稀释后的荧光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。
3. 吸走二抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
4. 滴加稀释后的 DAPI，室温避光 孵育 5~10 min。
5. PBST 中摇洗 3 次，每次 5 分钟。
封片
1. 抗荧光淬灭封片剂封片。
2. 干燥玻片，将玻片置于室温下避光过夜。
3. 将载玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
| SMN Antibody (Rabbit mAb) [C8K16] 可检测内源性 SMN 总蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
|---|
| 细胞突起，细胞质，细胞核 |
| Uniprot ID |
|---|
| Q16637 |
| 克隆号 |
|---|
| C8K16 |
| 别名 |
|---|
| SMN | SMNT | SMN2 | SMNC | SMN1 | Survival motor neuron protein | Component of gems 1 | Gemin-1 |
| 背景 |
|---|
| 运动神经元存活蛋白（SMN，在SMN-Gemin复合物中也称为Gemin 1）是一种普遍表达的RNA结合蛋白，由SMN1和SMN2基因编码，构成多亚基分子伴侣复合物的结构骨架，该复合物专门负责组装小核核糖核蛋白（snRNP），snRNP是剪接体的核心组成单元。SMN蛋白包含一个GEMIN2结合区、一个识别Sm蛋白上对称二甲基化精氨酸残基的Tudor结构域，以及一个介导SMN寡聚化的C端YG盒；这些结构域将SMN定位在一个环状SMN复合物的中心，该复合物包含Gemin2-7及其相关因子，并在snRNP生物合成过程中将Sm蛋白组织在snRNA周围。在分子伴侣辅助的组装途径中，SMN 和 Gemin2 从 CLNS1A–pICln 分子伴侣处接受预先加载的 5Sm 复合物，形成一个中间体，该中间体将 SmD1/D2、SmE/F/G 固定在能够结合 snRNA 的位置。随后，当 snRNA 结合后，SmD3 和 SmB 结合形成七聚体环，这些中间体被释放出来，生成成熟的核心 snRNP。这些核心 snRNP 随后被修饰、导入细胞核并整合到剪接体中。SMN 定位于细胞质和富含 snRNP 的 Cajal 小体附近的核内宝石结构中，这反映了其在 snRNP 成熟和运输过程中持续发挥作用，支持前体 mRNA 的剪接，包括 U12 型内含子的正确剪接，而 U12 型内含子对于运动神经元和本体感觉神经元的正常发育至关重要。除了参与snRNP组装外，SMN还与多种RNA结合蛋白和RNP蛋白（例如hnRNP U/R、GAR1、snoRNP组分）相互作用，并通过辅助去除RNA聚合酶II产生的RNA-DNA杂交体参与转录终止区域的R环解离，这凸显了SMN在RNA代谢、转录终止以及端粒酶和细胞骨架调控方面的更广泛功能。脊髓性肌萎缩症（SMA）证实了SMN与疾病的直接相关性。SMA是一种常染色体隐性遗传的运动神经元疾病，由SMN1基因的功能缺失突变或缺失引起，导致全长SMN蛋白减少，并引发广泛的剪接缺陷。脊髓运动神经元尤其容易受到snRNP可用性降低的影响，进而导致神经肌肉接头形成和脊髓回路发育紊乱。 SMN2是SMN1的近乎完全相同的着丝粒拷贝，它以剂量依赖的方式调节疾病的严重程度，但由于外显子7中单个核苷酸的改变破坏了剪接，SMN2主要产生缺失外显子7的转录本；只有少数SMN2转录本是全长的，能够产生功能性SMN蛋白，因此SMN2无法完全弥补SMN1的缺失，尽管较高的SMN2拷贝数与较轻的SMA表型相关。SMN表达的发育调控显示，在早期阶段SMN1和SMN2的表达水平较高，随后逐渐下降，这表明存在一个关键窗口期，当SMN水平降低到阈值以下时，神经肌肉接头和脊髓回路就会出现不可逆的缺陷；这一时间节点是治疗策略的基础，即在突触成熟受损之前上调SMN2的剪接以恢复SMN功能。 |
| 参考文献 |
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