SNAP25 Antibody (Rabbit mAb) [P1D7]
目录号: F7835
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: Mouse brain, Lane 2: Rat brain -
Immunofluorescent analysis of Neuro-2a cells using F7835 (green, 1:1250), Hoechst (blue) and tubulin (Red).
操作要点
WB
湿转参考条件：200 mA, 60 min。
湿转参考条件：200 mA, 60 min。
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB, IF, FCM |
| 反应性 |
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| Mouse, Human, Rat |
| 抗体类型 |
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| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
实际分子量
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23 kDa
27 kDa, 25 kDa
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| *为什么预测分子量和实际分子量会有不同？ 以下原因可能会导致蛋白分子量与预测不同：翻译后修饰（磷酸化/糖基化）；剪接变体和异构体；相对电荷；多聚体。 |
| 阳性对照 | Human brain tissue; Mouse brain tissue; Mouse hippocampus tissue; Rat brain tissue lysate; Rat hippocampus tissue; SH-SY5Y cells; Neuro-2a cells; K562 cells |
|---|---|
| 阴性对照 |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 60 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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| IF |
|---|
实验步骤：
样品准备
1. 贴壁细胞：取洁净无菌盖玻片置于培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片。
2. 悬浮细胞：将细胞接种至多聚赖氨酸包被的洁净无菌载玻片上。
3. 冰冻切片：将玻片置于室温下解冻，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。
4. 石蜡切片：先将玻片脱蜡至水，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。然后进行抗原修复。
固定
1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室温固定细胞爬片/涂片或组织切片 10~15 min。
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
通透
1. 对样品添加去垢剂，如 0.1~0.3% Triton X-100，室温通透 10~20 min。
（仅针对胞内抗原，若是细胞膜上表达的抗原则可省略该步骤。）
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
封闭
添加封闭液，在室温下封闭至少 1 h。（常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或山羊血清。）
注意事项：从封闭开始之后的所有步骤务必保证样品湿润，避免干燥，否则极易产生高背景。
免疫荧光染色（第一天）
1. 吸走封闭液，滴加稀释后的一抗。
2. 湿盒中 4°C 孵育过夜。
免疫荧光染色（第二天）
1. 吸走一抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
2. 滴加稀释后的荧光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。
3. 吸走二抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
4. 滴加稀释后的 DAPI，室温避光 孵育 5~10 min。
5. PBST 中摇洗 3 次，每次 5 分钟。
封片
1. 抗荧光淬灭封片剂封片。
2. 干燥玻片，将玻片置于室温下避光过夜。
3. 将载玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
| SNAP25 Antibody (Rabbit mAb) [P1D7] 可检测内源性 SNAP25 总蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
|---|
| 细胞膜，细胞质，内膜系统，突触，突触体 |
| Uniprot ID |
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| P60880 |
| 克隆号 |
|---|
| P1D7 |
| 别名 |
|---|
| SNAP, SNAP25, Synaptosomal-associated protein 25, SNAP-25, Super protein, Synaptosomal-associated 25 kDa protein, SUP |
| 背景 |
|---|
| SNAP25（突触体相关蛋白25）是突触小泡蛋白-突触蛋白-SNAP25家族中一种神经元富集的t-SNARE蛋白，它锚定于突触前质膜，并提供核心SNARE束中四个α螺旋中的两个，该核心SNARE束驱动突触小泡和其他分泌细胞器的快速Ca²⁺调节胞吐作用。该蛋白包含两个由柔性连接区隔开的SNARE基序，且缺乏跨膜结构域；中心区域聚集的半胱氨酸的棕榈酰化修饰使SNAP25靶向突触前膜富含胆固醇的区域，在那里它与突触蛋白-1和囊泡突触小泡蛋白/VAMP2组装成一个平行的四螺旋束，该螺旋束连接囊泡膜和质膜，并为膜融合提供能量。在这一融合机制中，SNAP25 发挥着核心组织平台的作用，它不仅构成螺旋核心的一半，还能结合突触结合蛋白、复合蛋白、Munc18 和 Munc13 等调控因子，以及决定释放概率、囊泡启动和 SNARE 拉链结构与 Ca²⁺ 感应偶联的支架蛋白。SNAP25 的 C 端 SNARE 基序包含突触结合蛋白-1 和突触结合蛋白-7 的特定结合位点，这些位点的靶向改变会改变囊泡停靠、启动和融合之间的平衡，表明 SNAP25 与突触结合蛋白的接触将 Ca²⁺ 传感器定位在部分拉链结构的 SNARE 复合物等待 Ca²⁺ 内流以触发最终融合的位置。 SNAP25参与多种胞吐途径，包括快速同步的突触小泡释放、异步自发的神经递质释放以及用于神经肽分泌的致密核心囊泡融合。SNAP25的存在或被SNAP23和SNAP29等同源蛋白部分功能性替代，决定了这些分泌事件的效率和发育时序。SNAP25在中枢神经系统神经元中的表达最高，其剪接异构体SNAP25a和SNAP25b的表达模式受发育调控，与突触传递和可塑性的成熟密切相关；从a异构体到b异构体的转换可以优化短期可塑性和释放动力学，而不会改变基本的SNARE结构。在通路层面，SNAP25参与神经递质释放循环，其通过PKA和PKC等激酶的磷酸化、棕榈酰化修饰以及与Ca²⁺通道和K⁺通道的相互作用，调控囊泡池的动态变化、突触前兴奋性以及动作电位与胞吐作用之间的耦合。SNAP25中与疾病相关的错义突变聚集在与突触结合蛋白和其他SNARE蛋白接触的区域，改变SNARE复合物组装的能量分布，降低囊泡启动效率，并改变自发释放与诱发释放之间的关系。这些机制缺陷与癫痫性脑病、智力障碍以及运动或神经发育障碍相关。 |
| 参考文献 |
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