TAB2 Antibody (Rabbit mAb) [E6J10]
目录号: F8283
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: Hela, Lane 2: 293T, Lane 3: NIH/3T3, Lane 4: PC-12
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB, IP |
| 反应性 |
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| Human, Mouse, Rat |
| 抗体类型 |
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| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
实际分子量
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76 kDa
80 kDa,36 kDa
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| *为什么预测分子量和实际分子量会有不同？ 以下原因可能会导致蛋白分子量与预测不同：翻译后修饰（磷酸化/糖基化）；剪接变体和异构体；相对电荷；多聚体。 |
| 阳性对照 | Mouse brain tissue; Rat brain tissue; A549 cells; HEK-293 cells; Raji cells; HeLa cells; 293T cells; NIH/3T3 cells; PC-12 cells; THP-1 cells; RAW 264.7 cells; NR8383 cells |
|---|---|
| 阴性对照 | Jurkat cells |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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| IP |
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实验步骤：
实验试剂与准备
1.基础缓冲液：1X PBS或1X TBS（冰浴预冷）；1X 细胞裂解液（临用前添加 1 mM PMSF 蛋白酶抑制剂；磷酸化蛋白加入磷酸酶抑制剂）。
2.捕获介质：Protein A/G 磁珠或琼脂糖珠（Sepharose beads）。
3.对照组：使用与一抗来源种属及 IgG 亚型相同、浓度相同的同型对照 IgG（isotype control）。建议同时保留一部分未经免疫沉淀的细胞裂解液作为 Input 对照；必要时可设置仅加入珠子、不加入抗体的 beads-only 对照。
4.上样与洗脱试剂：3X 或 4X SDS 上样缓冲液（含 DTT/还原剂）；如需进行非变性洗脱，可另行准备相应洗脱缓冲液及中和缓冲液；若采用变性洗脱，通常使用 1× PBS 将 3× 或 4× SDS 上样缓冲液稀释至 1×。
细胞裂解与样品制备（提取天然蛋白）
1.收集细胞：弃去培养基，用冰冷 1X PBS 洗涤细胞一次。
2.裂解细胞：向 10 cm 培养皿中加入 0.5-1 mL 冰浴 1X 细胞裂解液，冰上孵育 5–10 分钟。
3.收集裂解液并离心澄清：刮取细胞，将细胞裂解物转移至微量离心管中。一些贴壁细胞可能需要使用消化酶或机械方法进行分离。随后在 4°C、14,000 rpm 条件下离心 5-15 min，收集上清液，即为澄清后的细胞裂解液。建议测定蛋白浓度。
预清除与免疫沉淀反应
1.裂解液预清除（推荐）：取适量珠子（磁珠或琼脂糖珠），用细胞裂解液或1X TBS/PBS预洗 2–3 次。珠子预洗后，建议尽量去除洗液，再加入后续试剂，以避免额外稀释样品。对于含去污剂或特定盐浓度的裂解体系，优先使用与裂解液相同或相容的缓冲液预洗，以减少缓冲体系突变。
2.预清除处理：将细胞裂解液与预洗后的珠子混合，室温旋转孵育30-60 min，或4°C旋转孵育1-2 h。
若使用琼脂糖珠，孵育结束后通过离心沉降珠子，并收集上清液。
若使用磁珠，孵育结束后通过磁力架分离珠子，并收集上清液。
该步骤用于去除可与珠子发生非特异性结合的蛋白。对于不稳定蛋白、磷酸化蛋白或蛋白复合物，建议优先采用 4°C 孵育，以减少蛋白降解、去磷酸化或复合物解离。预清除使用的珠子通常不应预先偶联特异性抗体，以免损失目标抗原。
3.形成“珠子–抗体–抗原”免疫复合物
可采用以下两种方式之一：
3.1 先形成抗体-抗原复合物，再加入珠子：向步骤 2 获得的预清除上清液中加入适量一抗，同时设置同型对照 IgG 组。在 4°C 下旋转孵育过夜（推荐），或在室温下旋转孵育 2 h，以形成抗体–抗原复合物。
另取适量珠子，并按照本节步骤 1 的方法预洗。将抗体–抗原复合物加入预洗后的磁珠或琼脂糖珠中，在室温下旋转孵育 30 min–1 h，或在 4°C 下旋转孵育 1–2 h，使抗体–抗原复合物充分结合至珠子。
3.2 先形成珠子-抗体复合物，再加入细胞裂解液：按照抗体说明书推荐的稀释比例，使用细胞裂解液稀释一抗，配制抗体工作液。向抗体工作液中加入适量预洗后的磁珠，在室温下旋转孵育 15 min，或在 4°C 下旋转孵育 1 h，以形成珠子–抗体复合物。
通过磁性分离或离心沉降珠子，弃去上清液，并使用 1× TBS 预洗珠子 2–3 次。随后加入细胞裂解液，在 4°C 下旋转孵育过夜（推荐），或在室温下旋转孵育 2 h。
沉淀物洗涤与样品洗脱
1.免疫沉淀完成后，根据珠子类型进行分离，并弃去上清液。
磁珠使用磁力架进行磁性分离
琼脂糖珠应采用与所用珠子规格相匹配的低速离心条件（500–1000 rpm），避免高速离心造成珠子压实或损伤。
2.洗涤珠子：使用冰浴预冷的 1× 细胞裂解液或 1× TBS/TBST 轻柔洗涤珠子 3–5 次。洗涤过程中保持低温。每次加入洗涤液后，轻柔混匀，使珠子充分重悬；随后根据珠子类型使用磁力架或适当的离心条件分离珠子，并彻底去除洗涤液，以尽可能降低未结合及非特异性结合成分。每次洗涤时应尽量去除上清，但需避免吸走珠子。最后一次洗涤后应尽可能去除残余洗涤液，以免稀释洗脱液或影响后续分析。每次洗涤后将样品置于冰上。
3.样品洗脱（二选一）：
3.1变性直接洗脱法（最常用）：向珠子沉淀中加入 SDS 上样缓冲液，确保终浓度为 1×。若使用 3× 或 4× SDS 上样缓冲液，应先稀释至1×。混匀后加热至 95–100°C 保持 5 分钟。分离珠子，收集上清用于后续电泳。
3.2化学/非变性洗脱法（保留蛋白活性）：最后一次洗涤完成后，根据珠子类型使用磁力架或低速离心分离珠子，并尽可能去除残余洗涤液，避免稀释洗脱液。向珠子中加入适量酸性洗脱液/高盐洗脱液，使珠子充分重悬。在室温下轻柔混匀并短时间孵育，使免疫复合物从珠子上解离。使用磁力架或低速离心分离珠子，将洗脱上清液转移至预先加入适量中和缓冲液的收集管中，如有需要，进行必要的 pH 调节。如需提高回收率，可重复洗脱，并合并各次洗脱液。洗脱液、中和缓冲液的组成及用量应根据所用珠子和试剂盒的说明书确定。
3.3 洗脱后的样品处理
用于蛋白活性、天然蛋白复合物或其他非变性分析时：不加入 SDS 上样缓冲液；将样品置于冰上，并尽快用于后续实验。
用于 SDS-PAGE 或 Western blot 时：向中和或脱盐后的洗脱液中加入 SDS 上样缓冲液，使其终浓度为 1×，再按照后续电泳要求处理样品。
根据目标蛋白的稳定性及下游实验要求选择适宜的保存条件，并尽量避免反复冻融。
下游分析
Western Blot 分析：取上清进行 SDS-PAGE 电泳及转膜。建议使用轻重链特异性或构象特异性（Conformation Specific）二抗，以避免免疫球蛋白重/轻链（50 kDa / 25 kDa）条带对目的蛋白检测的干扰。建议在同一 Western blot 中设置 Input、同型对照 IgG-IP 和目标抗体-IP 样品；必要时还可加入 beads-only 对照，以评估免疫沉淀效率和非特异性结合。 激酶活性检测（如适用）：跳过变性步骤，用激酶缓冲液洗涤珠子后，直接加入底物与 ATP 进行激酶反应。
注意：整个裂解与免疫沉淀操作流程均应在 4°C 或冰浴条件下进行，以最大程度保持蛋白质的天然构象并防止其降解。 |
生物描述
| 特异性 |
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| TAB2 Antibody (Rabbit mAb) [E6J10] 可检测内源性 TAB2 总蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
|---|
| 细胞质，内体，溶酶体，内膜系统 |
| Uniprot ID |
|---|
| Q9NYJ8 |
| 克隆号 |
|---|
| E6J10 |
| 别名 |
|---|
| TAB2，CHTD2 |
| 背景 |
|---|
| TAB2（TAK1 结合蛋白 2/MAP3K7IP2）是 TAK1–TAB 支架家族的泛素结合衔接蛋白，它将受体下游产生的 Lys63 连接的多泛素信号与 MAP3K7/TAK1 的激活以及不同的 NF-κB、JNK 和非经典 Wnt 通路连接起来，同时还在生存信号传导和心脏稳态中发挥特定作用。该蛋白质包含一个 N 端 CUE/GLUE 样区域和卷曲螺旋片段，介导与 TAK1 和其他伙伴的结合，以及一个 C 端 RanBP2 型锌指 (NZF) 结构域，该结构域结合 Lys63 连接和混合 Lys63/Lys48 连接的多聚泛素链，这些多聚泛素链未锚定或连接到 RIPK1 和 RIPK2 等底物上，从而形成一个支架，将 TAK1 定位在泛素修饰的受体复合物附近，并促进 TAK1 的自身磷酸化。在IL-1或TNF家族配体刺激下，TAB2从细胞膜转位至胞质，并将含有TRAF6或RIPK的泛素平台与TAK1-TAB1连接起来，从而激活TAK1，并随后磷酸化驱动NF-κB和JNK信号通路的IKK核心复合物和MKK，进而将受体近端泛素化与控制炎症、细胞凋亡和增殖的转录反应相偶联。TAB2还能在Wnt信号通路中将TAK1与Nemo样激酶（NLK）连接起来；在这种情况下，TAB2相关的TAK1-NLK可磷酸化LEF1/TCF转录因子并抑制β-catenin依赖性转录，表明TAB2可以支持非经典Wnt信号通路，从而在发育和组织稳态过程中平衡经典Wnt信号通路。遗传和生化分析表明，TAB2并非所有TAK1依赖的NF-κB和MAPK激活所必需，它在TNF信号通路中发挥着额外的作用，尤其是在细胞毒性复合物II水平。TAB2通过NZF介导与泛素化组分结合，限制了凋亡和坏死性凋亡诱导复合物的丰度，并维持着一个独立于TAK1募集的促生存检查点。在心肌中，TAB2在维持心肌结构和功能方面起着至关重要的作用：小鼠心脏中TAB2的缺失会促进RIPK1依赖的凋亡和坏死性凋亡，放大炎症信号，并导致进行性扩张型心肌病。这表明，TAB2依赖的RIPK1复合物调控对于心肌稳态和应激下的重塑至关重要。在患有综合征性先天性心脏缺陷、成人发病型心肌病和结缔组织特征的家族中，杂合子TAB2变异体的存在与心脏发育和长期心室完整性对TAB2信号支架的剂量敏感性需求相一致。TAB2还与核受体共调节因子（如NCOR1和雌激素受体α）在乳腺癌细胞中相互作用，其中TAB2的特定中心结构域介导NCOR1从染色质上与拮抗剂结合的ERα上解离，并导致他莫昔芬耐药；竞争性肽破坏TAB2-ERα界面可恢复对他莫昔芬的抗增殖反应。 |
| 参考文献 |
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