TFIIB Antibody [H2N6]

目录号: F4717

抗体应用：反应性：Human, Mouse, Rat, Monkey

Lane 1: Hela, Lane 2: 3T3, Lane 3: H-4-II-E, Lane 4: COS

规格	价格	库存
20uL	790	现货
50uL	1240	现货
100uL	1990	现货
100uL*2	3790	现货
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操作要点

WB
湿转参考条件：200 mA, 60 min。

使用信息

稀释比例
WB1:1000 IP1:100

抗体应用
WB, IP

反应性
Human, Mouse, Rat, Monkey

抗体类型
Mouse Monoclonal Antibody

储存液配方
PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件(自收到货起)
-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

预测分子量
32 kDa

阳性对照	HeLa cells; NIH/3T3 cells; H-4-II-E cells; COS cells
阴性对照

实验方法

WB
实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 60 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 60 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

Datasheet & SDS

生物描述

特异性
TFIIB Antibody [H2N6] 可检测内源性 TFIIB 总蛋白水平。

蛋白定位
染色体，细胞核

Uniprot ID
Q00403

克隆号
H2N6

别名
Transcription initiation factor IIB; General transcription factor TFIIB; S300-II; GTF2B; TF2B; TFIIB

背景
TFIIB 是一种普遍存在的通用转录因子，对于 RNA 聚合酶 II 前起始复合物在含有 TATA 盒的启动子处的组装至关重要，它将启动子结合的 TFIID（特别是 TBP）与 Pol II-TFIIF 连接起来，并精确定位转录起始位点。 TFIIB 包含一个 N 端锌带结构域，跨越氨基酸 1 至 75，具有 C(X)2C(X)12-15H(X)4-6C 基序，可协调锌与 RPB1 dock2 和 RPB9 相互作用；一个 B 读取螺旋环，从氨基酸 155 至 169，插入 Pol II 模板通道并通过互补的 TA 碱基配对识别起始元件；一个 B 连接子，从氨基酸 170 至 200，形成柔性螺旋，限制活性位点金属 B；以及一个 C 端核心结构域，由五个不完全串联重复序列组成，形成鞍形平台，其中两个 DNA 结合模块通过 Arg180 和 Lys35 等碱性残基与 TATA 盒侧翼的 BREu 和 BREd 元件接触。 TFIIB介导有序的PIC组装：其核心蛋白钳制TBP诱导的约90度DNA弯曲，延伸TATA盒上游和下游的蛋白质接触；通过锌指结构域募集Pol II-TFIIF，将对接角度稳定在约45度；B-reader蛋白对齐起始模板链，突变会使转录起始位点移动约10个核苷酸；连接蛋白通过重新定位Glu414并协调Mg2+B，变构重排Pol II活性位点裂隙，从而促进启动子解链和终止性起始，随后启动子被清除。TFIIH激酶对TFIIB的磷酸化会在合成10个核苷酸的RNA后触发其解离。 TFIIB通过整合TATA元件、起始元件和BRE元件来增强启动子特异性，其N端区域响应VP16和GAL4等转录激活因子，并调控Pol II的暂停释放。其古细菌同源物可将基础转录起始提高约五倍。TFIIB突变（例如R178H）会损害PIC的稳定性，从而导致神经发育障碍；在某些癌症中，TFIIB的过表达会劫持Pol II进行癌基因转录。

背景

TFIIB 是一种普遍存在的通用转录因子，对于 RNA 聚合酶 II 前起始复合物在含有 TATA 盒的启动子处的组装至关重要，它将启动子结合的 TFIID（特别是 TBP）与 Pol II-TFIIF 连接起来，并精确定位转录起始位点。 TFIIB 包含一个 N 端锌带结构域，跨越氨基酸 1 至 75，具有 C(X)2C(X)12-15H(X)4-6C 基序，可协调锌与 RPB1 dock2 和 RPB9 相互作用；一个 B 读取螺旋环，从氨基酸 155 至 169，插入 Pol II 模板通道并通过互补的 TA 碱基配对识别起始元件；一个 B 连接子，从氨基酸 170 至 200，形成柔性螺旋，限制活性位点金属 B；以及一个 C 端核心结构域，由五个不完全串联重复序列组成，形成鞍形平台，其中两个 DNA 结合模块通过 Arg180 和 Lys35 等碱性残基与 TATA 盒侧翼的 BREu 和 BREd 元件接触。 TFIIB介导有序的PIC组装：其核心蛋白钳制TBP诱导的约90度DNA弯曲，延伸TATA盒上游和下游的蛋白质接触；通过锌指结构域募集Pol II-TFIIF，将对接角度稳定在约45度；B-reader蛋白对齐起始模板链，突变会使转录起始位点移动约10个核苷酸；连接蛋白通过重新定位Glu414并协调Mg2+B，变构重排Pol II活性位点裂隙，从而促进启动子解链和终止性起始，随后启动子被清除。TFIIH激酶对TFIIB的磷酸化会在合成10个核苷酸的RNA后触发其解离。 TFIIB通过整合TATA元件、起始元件和BRE元件来增强启动子特异性，其N端区域响应VP16和GAL4等转录激活因子，并调控Pol II的暂停释放。其古细菌同源物可将基础转录起始提高约五倍。TFIIB突变（例如R178H）会损害PIC的稳定性，从而导致神经发育障碍；在某些癌症中，TFIIB的过表达会劫持Pol II进行癌基因转录。

参考文献
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/27798851/ https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/22223047/

PVDF膜孔径规格选择参照表

Protein Size (kDa)	PVDF Transfer Membrane Pore Size (μm)
< 10	0.22
10-20	0.22
20-30	0.45
30-45	0.45
45-70	0.45
80-100	0.45
100-140	0.45
> 140	0.45

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* 必填项

Protein Size (kDa)	Separating Gel Percentage
4-40	20%
12-45	15%
10-70	12.5%
15-100	10%
25-100	8%
60-210	5%