TIA1 Antibody (Rabbit mAb) [A18M15]
目录号: F2596
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: Jurkat, Lane 2: MOLT-4, Lane 3: K562
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB, IP, IHC, IF, FCM |
| 反应性 |
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| Human |
| 抗体类型 |
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| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
实际分子量
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43 kDa
43 kDa
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| *为什么预测分子量和实际分子量会有不同？ 以下原因可能会导致蛋白分子量与预测不同：翻译后修饰（磷酸化/糖基化）；剪接变体和异构体；相对电荷；多聚体。 |
| 阳性对照 | Human classical Hodgkin lymphoma tissue; Human gastric cancer tissue; Human spleen tissue; Human tonsil tissue; HAP1 cells; Jurkat cells; HuT-78 cells; MOLT-4 cells; K562 cells |
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| 阴性对照 |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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| IF |
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实验步骤：
样品准备
1. 贴壁细胞：取洁净无菌盖玻片置于培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片。
2. 悬浮细胞：将细胞接种至多聚赖氨酸包被的洁净无菌载玻片上。
3. 冰冻切片：将玻片置于室温下解冻，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。
4. 石蜡切片：先将玻片脱蜡至水，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。然后进行抗原修复。
固定
1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室温固定细胞爬片/涂片或组织切片 10~15 min。
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
通透
1. 对样品添加去垢剂，如 0.1~0.3% Triton X-100，室温通透 10~20 min。
（仅针对胞内抗原，若是细胞膜上表达的抗原则可省略该步骤。）
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
封闭
添加封闭液，在室温下封闭至少 1 h。（常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或山羊血清。）
注意事项：从封闭开始之后的所有步骤务必保证样品湿润，避免干燥，否则极易产生高背景。
免疫荧光染色（第一天）
1. 吸走封闭液，滴加稀释后的一抗。
2. 湿盒中 4°C 孵育过夜。
免疫荧光染色（第二天）
1. 吸走一抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
2. 滴加稀释后的荧光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。
3. 吸走二抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
4. 滴加稀释后的 DAPI，室温避光 孵育 5~10 min。
5. PBST 中摇洗 3 次，每次 5 分钟。
封片
1. 抗荧光淬灭封片剂封片。
2. 干燥玻片，将玻片置于室温下避光过夜。
3. 将载玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。
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| IHC |
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实验步骤：
脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片：
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
| TIA1 Antibody (Rabbit mAb) [A18M15] 可检测内源性 TIA1 总蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
|---|
| 细胞质，细胞核 |
| Uniprot ID |
|---|
| P31483 |
| 克隆号 |
|---|
| A18M15 |
| 别名 |
|---|
| Cytotoxic granule associated RNA binding protein TIA1, Nucleolysin TIA-1 isoform p40, RNA-binding protein TIA-1, T-cell-restricted intracellular antigen-1, p40-TIA-1, TIA-1, TIA1 |
| 背景 |
|---|
| TIA1是一种多功能RNA结合蛋白，属于RNA识别基序家族，广泛表达，在神经和免疫组织中含量丰富。它含有三个N端RNA识别基序（RRM），可结合3′UTR和内含子中的富含U的元件；此外，它还含有一个C端朊病毒样低复杂度结构域，该结构域调控TIA1组装成更高级的核糖核蛋白结构。RRM及其邻近区域引导TIA1结合参与应激反应、细胞凋亡和免疫调节的特定mRNA靶标；而朊病毒样结构域则支持TIA1在氧化应激、缺氧或病毒感染等不利条件下发生可逆的相分离和聚集形成应激颗粒，从而为TIA1将序列特异性RNA识别与动态凝聚体形成相偶联提供了结构基础。在稳态条件下，TIA1 主要存在于细胞核内，参与前体 mRNA 加工和选择性剪接，包括调节 Fas 受体剪接和 EIF2AK2 连接通路，从而影响凋亡相关基因和干扰素反应基因的表达；应激后，TIA1 转移到细胞质中，通过其朊病毒样结构域自组装形成应激颗粒，并将 mRNA 和其他 RNA 结合蛋白组装成非翻译复合物，从而暂停整体蛋白质合成，同时保留恢复所需的转录本。 PAR-CLIP 和功能分析表明，TIA1 及其旁系同源物 TIAL1 结合 3′UTR 和内含子中重叠的富含 U 的位点，抑制翻译或促进部分 mRNA 的降解，并调节 EIF2AK2 (PKR) 介导的 eIF2α 磷酸化，使 TIA1 处于 RNA 代谢和整合应激反应信号通路的交汇点。在肌萎缩侧索硬化症 (ALS) 和额颞叶痴呆 (FTD) 中发现的 TIA1 朊病毒样结构域的疾病相关突变增加了 TIA1 发生相变的内在倾向，延缓了应激颗粒的解体，并促进形成更静态、高度浓缩的应激颗粒，这些颗粒捕获 TAR DNA 结合蛋白 43 (TDP-43)，降低其流动性并使其不溶，从而产生 ALS/FTD 神经病理学中观察到的特征性圆形 TDP-43 阳性包涵体。在C9orf72相关ALS模型中，TIA1在运动皮层神经元中表达上调，其应激颗粒活性会隔离HSP70家族mRNA，从而降低HSP70的表达并损害UBQLN2-HSP70介导的poly-GA聚集体的清除；在神经系统中条件性敲除TIA1可减少运动神经元丢失、神经炎症和运动功能障碍，表明TIA1介导的应激颗粒在此遗传背景下对神经退行性变有直接贡献。致病性TIA1变异体还会通过干扰应激颗粒动力学和自噬蛋白降解，驱动多系统蛋白病中的肌变性，从而将TIA1失调的相关性从运动神经元扩展到肌肉和其他组织，并强调了其朊病毒样结构域和颗粒行为在退行性疾病谱中的核心地位。 |
| 参考文献 |
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