TNF-R1 Antibody [M22M6]

目录号: F4224

抗体应用：反应性：Mouse, Rat

Lane 1: L-929, Lane 2: 3T3, Lane 3: C6, Lane 4: KNRK

规格	价格	库存
20uL	790	现货
50uL	1240	现货
100uL	1990	现货
100uL*2	3790	现货
400-668-6834 info@selleck.cn

使用信息

稀释比例
WB1:1000

抗体应用
WB

反应性
Mouse, Rat

抗体类型
Rabbit Monoclonal Antibody

储存液配方
PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件(自收到货起)
-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

预测分子量
55 kDa

阳性对照	L-929 cells; 3T3 cells; C6 cells; KNRK cells
阴性对照

实验方法

WB
实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 120 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

Datasheet & SDS

生物描述

特异性
TNF-R1 Antibody [M22M6] 可检测内源性 TNF-R1 总蛋白水平。

蛋白定位
细胞膜，高尔基体，内膜系统

Uniprot ID
P25118

克隆号
M22M6

别名
Tumor necrosis factor receptor superfamily member 1A; Tumor necrosis factor receptor 1 (TNF-R1); Tumor necrosis factor receptor type I (TNF-RI; TNFR-I); p55; p60; CD120a; Tnfrsf1a; Tnfr-1; Tnfr1

背景
TNF-R1，也称为TNFRSF1A或CD120a，是一种广泛表达的跨膜受体，属于TNF受体超家族，主要介导TNF-α信号通路，从而调节多种细胞类型的炎症、细胞存活和凋亡。TNF-R1由一个胞外结构域和四个富含半胱氨酸的亚结构域CRD1至CRD4组成。其中，CRD1至CRD3作为A1/B2模块发挥作用，CRD4包含促进受体聚集的A1/C2模块。胞外结构域之后是一个跨膜螺旋和一个约180个氨基酸残基的胞内尾，胞内尾包含一个约70个氨基酸残基的死亡结构域，该结构域由六个α螺旋组成，并通过保守基序（例如Asp245和Arg347）形成TRADD结合界面。当与三聚体TNF-α结合时，预先配体的受体二聚体或三聚体通过CRD1、PLAD和CRD4聚集，诱导构象变化，从而暴露死亡结构域以募集TRADD。该过程启动由TRADD、RIP1、TRAF2和cIAP1/2组成的复合物I的形成，该复合物促进K63和K11连接的泛素化，并激活NF-κB/IKK通路，进而通过RelA/p50以及MAPK和JNK信号通路驱动促生存和炎症反应。此外，当生存信号不足时，TNF-R1可以组装包含TRADD、FADD和caspase-8的复合物II，从而触发外源性凋亡。 TNF-R1的核心生物学功能是平衡免疫防御（例如细胞因子生成和白细胞募集）与免疫病理风险，而低pH值下的受体内吞作用会导致复合物解离和信号终止。TNF-R1与自身免疫性疾病（例如类风湿性关节炎和炎症性肠病）密切相关。

背景

TNF-R1，也称为TNFRSF1A或CD120a，是一种广泛表达的跨膜受体，属于TNF受体超家族，主要介导TNF-α信号通路，从而调节多种细胞类型的炎症、细胞存活和凋亡。TNF-R1由一个胞外结构域和四个富含半胱氨酸的亚结构域CRD1至CRD4组成。其中，CRD1至CRD3作为A1/B2模块发挥作用，CRD4包含促进受体聚集的A1/C2模块。胞外结构域之后是一个跨膜螺旋和一个约180个氨基酸残基的胞内尾，胞内尾包含一个约70个氨基酸残基的死亡结构域，该结构域由六个α螺旋组成，并通过保守基序（例如Asp245和Arg347）形成TRADD结合界面。当与三聚体TNF-α结合时，预先配体的受体二聚体或三聚体通过CRD1、PLAD和CRD4聚集，诱导构象变化，从而暴露死亡结构域以募集TRADD。该过程启动由TRADD、RIP1、TRAF2和cIAP1/2组成的复合物I的形成，该复合物促进K63和K11连接的泛素化，并激活NF-κB/IKK通路，进而通过RelA/p50以及MAPK和JNK信号通路驱动促生存和炎症反应。此外，当生存信号不足时，TNF-R1可以组装包含TRADD、FADD和caspase-8的复合物II，从而触发外源性凋亡。 TNF-R1的核心生物学功能是平衡免疫防御（例如细胞因子生成和白细胞募集）与免疫病理风险，而低pH值下的受体内吞作用会导致复合物解离和信号终止。TNF-R1与自身免疫性疾病（例如类风湿性关节炎和炎症性肠病）密切相关。

参考文献
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/23886067/ https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33495441/

PVDF膜孔径规格选择参照表

Protein Size (kDa)	PVDF Transfer Membrane Pore Size (μm)
< 10	0.22
10-20	0.22
20-30	0.45
30-45	0.45
45-70	0.45
80-100	0.45
100-140	0.45
> 140	0.45

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* 必填项

Protein Size (kDa)	Separating Gel Percentage
4-40	20%
12-45	15%
10-70	12.5%
15-100	10%
25-100	8%
60-210	5%