TOM70 Antibody (Rabbit mAb) [N12A7]
目录号: F7444
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: HepG2, Lane 2: Hela, Lane 3: Mouse brain, Lane 4: Rat brain
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB, IP, IHC, IF, FCM |
| 反应性 |
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| Human, Mouse, Rat |
| 抗体类型 |
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| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
实际分子量
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67 kDa
72 kDa, 70 kDa
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| *为什么预测分子量和实际分子量会有不同？ 以下原因可能会导致蛋白分子量与预测不同：翻译后修饰（磷酸化/糖基化）；剪接变体和异构体；相对电荷；多聚体。 |
| 阳性对照 | Human cerebrum tissue; Human colon tissue; Human breast cancer tissue; Human esophagus tissue; Mouse brain tissue; Mouse liver tissue; Rat brain tissue; Rat liver tissue; Rat breast tissue; HeLa cells; U-2 OS cells; HepG2 cells; NIH/3T3 cells; C6 cells |
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| 阴性对照 |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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| IF |
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实验步骤：
样品准备
1. 贴壁细胞：取洁净无菌盖玻片置于培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片。
2. 悬浮细胞：将细胞接种至多聚赖氨酸包被的洁净无菌载玻片上。
3. 冰冻切片：将玻片置于室温下解冻，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。
4. 石蜡切片：先将玻片脱蜡至水，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。然后进行抗原修复。
固定
1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室温固定细胞爬片/涂片或组织切片 10~15 min。
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
通透
1. 对样品添加去垢剂，如 0.1~0.3% Triton X-100，室温通透 10~20 min。
（仅针对胞内抗原，若是细胞膜上表达的抗原则可省略该步骤。）
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
封闭
添加封闭液，在室温下封闭至少 1 h。（常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或山羊血清。）
注意事项：从封闭开始之后的所有步骤务必保证样品湿润，避免干燥，否则极易产生高背景。
免疫荧光染色（第一天）
1. 吸走封闭液，滴加稀释后的一抗。
2. 湿盒中 4°C 孵育过夜。
免疫荧光染色（第二天）
1. 吸走一抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
2. 滴加稀释后的荧光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。
3. 吸走二抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
4. 滴加稀释后的 DAPI，室温避光 孵育 5~10 min。
5. PBST 中摇洗 3 次，每次 5 分钟。
封片
1. 抗荧光淬灭封片剂封片。
2. 干燥玻片，将玻片置于室温下避光过夜。
3. 将载玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
| TOM70 Antibody (Rabbit mAb) [N12A7] 可检测内源性 TOM70 总蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
|---|
| 内膜系统，线粒体，线粒体外膜 |
| Uniprot ID |
|---|
| O94826 |
| 克隆号 |
|---|
| N12A7 |
| 别名 |
|---|
| KIAA0719, TOM70, TOMM70A, TOMM70, Translocase of outer mitochondrial membrane protein 70 |
| 背景 |
|---|
| TOM70 (TOMM70) 是线粒体外膜转位酶 (TOM) 复合物的四肽重复序列 (TPR) 受体，它将胞质伴侣结合的前体蛋白连接到通用导入孔，并且在哺乳动物细胞中，它还作为接头蛋白，将线粒体抗病毒信号传导与 IRF3 依赖性转录和病毒诱导的细胞凋亡偶联起来。胞质结构域完全呈螺旋状，并由重复的TPR基序组成，形成两个功能特化的区域：一个N端钳状结构，可识别Hsp70/Hsc70和Hsp90中保守的C端EEVD基序；以及一个C端前体蛋白结合槽，可与载体型和其他非经典线粒体前体蛋白中的内部靶向信号和内部MTS样片段结合。此外，一个C端跨膜锚定结构将TOM70锚定在面向胞质的外膜上。在线粒体蛋白生物合成过程中，TOM70识别以Hsp70/Hsp90-底物复合物形式呈现的疏水性或复杂的前体蛋白，同时结合分子伴侣和底物，并将前体蛋白定位以便转运至TOM40通道，从而提高导入效率，尤其对于载体和其他含有分散内部靶向信息的含前导序列的底物而言。 TOM70 的缺失或突变会降低多种疏水性和多通道蛋白的导入，增加胞质溶胶中错误靶向的前体蛋白的负担，并引发线粒体蛋白应激。结构和生化研究表明，TPR 阵列开放和关闭状态之间的构象变化（通过特定螺旋传递）协调分子伴侣的结合和前体蛋白的交接，而 TOM70 依赖的分子伴侣向线粒体表面的募集是其抵抗线粒体前体蛋白积累引起的蛋白毒性的主要决定因素。在固有免疫中，TOM70 作为线粒体接头蛋白，参与 RIG-I 样受体信号传导：位于线粒体外膜的 MAVS 募集 TOM70，后者与 Hsp90 相关蛋白 TBK1 和 IRF3 结合，形成信号转导平台。该平台促进 IRF3 磷酸化，并在感染仙台病毒等 RNA 病毒后诱导 I 型干扰素的产生，从而整合线粒体界面动力学与抗病毒转录反应。在相同刺激下，TOM70 还在线粒体表面组装一个促凋亡复合物，该复合物包含 HSP90AA1、IRF3 和促凋亡 BCL-2 家族成员 BAX。在该复合物中，IRF3 发挥非转录效应作用，与 BAX 协同作用，增加线粒体通透性，促进细胞凋亡，并通过 TOM70 依赖性机制将抗病毒信号传导与感染细胞的清除联系起来。在这些途径中，TOM70 占据双重地位，既是线粒体导入的核心受体，又是线粒体外膜上的支架，可以招募分子伴侣、激酶、转录因子和凋亡调节因子。 |
| 参考文献 |
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