Ubc12 Antibody [K5G17]
目录号: F5062
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: Hela, Lane 2: NIH/3T3, Lane 3: C6, Lane 4: COS-7
操作要点
WB
湿转参考条件：200 mA, 60 min。
湿转参考条件：200 mA, 60 min。
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB, IP |
| 反应性 |
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| Human, Mouse, Rat, Monkey |
| 抗体类型 |
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| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
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21 kDa
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| 阳性对照 | HeLa cells; NIH/3T3 cells; C6 cells; COS-7 cells; 293 cells |
|---|---|
| 阴性对照 |
实验方法
| WB |
|---|
实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 60 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
| Ubc12 Antibody [K5G17] 可检测内源性 Ubc12 总蛋白水平。 |
| Uniprot ID |
|---|
| P61081 |
| 克隆号 |
|---|
| K5G17 |
| 别名 |
|---|
| NEDD8-conjugating enzyme Ubc12; NEDD8 carrier protein; Ubiquitin-conjugating enzyme E2 M; UBE2M; UBC12 |
| 背景 |
|---|
| Ubc12 是 NEDD8 在 NEDD8 修饰级联反应中的特异性 E2 结合酶，它与其他泛素结合酶类似，但能特异性地激活 cullin-RING 连接酶 (CRL)，通过将 NEDD8 转移到 cullin 支架上的赖氨酸残基上，从而增强对蛋白质稳态至关重要的泛素连接酶活性。它具有典型的 UBC 折叠结构，并带有柔性的 C 端延伸，这有利于与 NEDD8~E1 硫酯形成异二聚体，从而在 CAND1 等抑制因子被置换后，能够直接转移到未 NEDD8 修饰的 cullin 上。结合了 NEDD8 的 Ubc12 促进 cullin 的构象重塑，重新定位 Cul-Rbx1 RING 亚结构域，从而募集 Cdc34 等泛素 E2，在底物上进行 K48/K63 链的连续组装；在SCF^βTrCP复合物中，NEDDylation修饰对于最佳的磷酸化依赖性IκBα识别、泛素化和蛋白酶体降解至关重要，从而释放NF-κB p65/p50的核转位，进而转录TNF-α和IL-6等促炎细胞因子。而在SCF^Skp2复合物中，NEDDylation修饰通过稳定Skp1-Skp2的对接来驱动p27^Kip1的周转，并激活CDK2以促进G1/S期转换。Ubc12介导的NEDDylation修饰的动态循环与CSN介导的去NEDDylation修饰相拮抗，Skp2-Skp1主动将CAND1从Cul1上解离，从而促进NEDDylation修饰；同时，结合的底物则屏蔽NEDDylation修饰的Cul1免受CSN的影响，从而在信号传导过程中维持CRL的活性。 Ubc12 通过确保 NF-κB 抑制剂和 CDK 调节因子的及时降解来调控免疫激活、细胞周期稳定性以及发育模式，因此对于研究增殖或炎症中 CRL 依赖性的研究人员来说，Ubc12 至关重要，因为在这些情况下，NEDDylation 抑制会模拟 cullin 缺失的表型。Ubc12 的活性通过 NF-κB 振荡来维持上皮屏障的完整性和造血稳态，其广泛的表达支持了用于组织特异性通路解析的条件性敲除模型。NEDDylation 阻断导致的失调会积累 IκB 和 p27，从而减弱先天免疫反应并抑制细胞增殖，这已在炎症性肠病模型和肿瘤发生过程中得到证实。 |
| 参考文献 |
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