UCH37 Antibody (Rabbit mAb) [P22L1]
目录号: F2941
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: Mouse brain, Lane 2: Rat brain
操作要点
WB
湿转参考条件：200 mA, 60 min。
建议一抗稀释比: 1:10000
湿转参考条件：200 mA, 60 min。
建议一抗稀释比: 1:10000
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB, IHC |
| 反应性 |
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| Mouse, Rat, Human |
| 抗体类型 |
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| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
实际分子量
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37 kDa
36 kDa
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| *为什么预测分子量和实际分子量会有不同？ 以下原因可能会导致蛋白分子量与预测不同：翻译后修饰（磷酸化/糖基化）；剪接变体和异构体；相对电荷；多聚体。 |
| 阳性对照 | Mouse liver tissue; Human colorectal carcinoma tissue; Rat liver tissue; Human colon tissue; Mouse breast tissue; Rat brain tissue |
|---|---|
| 阴性对照 |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 60 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:10000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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| IHC |
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实验步骤：
脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片：
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
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生物描述
| 特异性 |
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| UCH37 Antibody (Rabbit mAb) [P22L1] 可检测内源性 UCH37 总蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
|---|
| 细胞质，细胞核，蛋白酶体 |
| Uniprot ID |
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| Q9Y5K5 |
| 克隆号 |
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| P22L1 |
| 别名 |
|---|
| UCH37, AD-019, CGI-70, UCHL5, Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase isozyme L5, UCH-L5, Ubiquitin C-terminal hydrolase UCH37, Ubiquitin thioesterase L5 |
| 背景 |
|---|
| UCH37 (UCHL5) 是一种泛素C端水解酶家族的去泛素化酶，它与26S蛋白酶体的19S调节颗粒以及INO80染色质重塑复合物结合，通过编辑底物上的泛素链来调节蛋白酶体降解和染色质相关过程。该酶包含一个N端催化结构域，其中含有UCH家族典型的保守Cys-His-Asp三联体；以及一个C端尾部，该尾部可结合蛋白酶体受体RPN13。与游离酶相比，蛋白酶体结合的UCH37表现出显著增强的活性和改变的底物选择性。蛋白酶体相关蛋白UCH37选择性地切割K48连接的支链多聚泛素的分支点，从复杂的链结构中释放短的泛素寡聚体，同时将剩余的链留在底物上。因此，UCH37主要发挥“去分支”去泛素化酶（DUB）的作用，而非一般的链修剪酶。UCH37的去分支作用促进了支链泛素化底物与蛋白酶体的高效结合和转运：重组蛋白酶体实验表明，去除分支点可加速多周转条件下的降解；UCH37缺陷细胞的脉冲追踪蛋白质组学分析显示整体蛋白质周转受损，这与UCH37在促进高度泛素化底物清除中的作用相符。蛋白酶体和INO80复合物中存在不同的调控模式。RPN13的结合激活UCH37，使其在蛋白酶体上向分支链方向移动；而不同的相互作用蛋白则调节其在染色质上的活性。这表明，相互作用蛋白和局部环境控制着UCH37何时何地编辑泛素信号。在癌症和神经退行性疾病中，UCH37是几种蛋白酶体相关的去泛素化酶（DUB）之一，其表达或活性的改变会扰乱泛素-蛋白酶体系统的功能；多种肿瘤中均报道了UCH37表达升高，其去分支能力的改变会影响致癌或促凋亡底物的稳定性。此外，泛素信号传导和蛋白酶体加工的失调是神经退行性疾病的常见特征，在这些疾病中，泛素化蛋白会发生积累。 |
| 参考文献 |
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