VEGF Receptor 3 Antibody (Rabbit mAb) [M6F2]
目录号: F9678
抗体应用：
反应性：
操作要点
WB
建议 SDS-PAGE 分离胶浓度：5%。
建议 SDS-PAGE 分离胶浓度：5%。
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB |
| 反应性 |
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| Human |
| 抗体类型 |
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| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
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153 kDa
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实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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生物描述
| 特异性 |
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| VEGF Receptor 3 Antibody (Rabbit mAb) [M6F2] 可检测内源性 VEGF Receptor 3 总蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
|---|
| 细胞膜，细胞质，内膜系统 |
| Uniprot ID |
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| P35916 |
| 克隆号 |
|---|
| M6F2 |
| 别名 |
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| CHTD7, Feline McDonough Sarcoma (FMS)-like tyrosine kinase 4, FLT-4, FLT4, FLT41, tyrosine kinase 4, LMPH1A, LMPHM1, PCL, primary congenital lymphedema, soluble VEGFR3 variant 1, soluble VEGFR3 variant 2, soluble VEGFR3 variant 3, VEGF receptor-3, VEGFR-3, VEGFR3, VGFR3 |
| 背景 |
|---|
| 血管内皮生长因子受体3（VEGFR3，FLT4）是血管内皮生长因子受体家族中的一种III型受体酪氨酸激酶，主要表达于出生后组织的淋巴管内皮细胞上，并通过选择性结合VEGF-C和VEGF-D的加工形式，发挥淋巴管生成和淋巴管稳态的主要调节作用。该受体包含七个胞外免疫球蛋白样结构域，可与二聚体VEGF-C或VEGF-D配体结合；一个跨膜区段；以及一个胞内分裂的酪氨酸激酶结构域，该结构域含有多个调节性酪氨酸残基，其磷酸化控制着信号复合物的募集。因此，配体诱导的二聚化会触发反式自身磷酸化，并将VEGFR3转化为淋巴管内皮表面的活性信号枢纽。 VEGF-C/VEGFR3信号通路通过与受体直接相互作用激活磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K），进而刺激PI3K-Akt通路，导致下游靶点（包括p70S6K、内皮型一氧化氮合酶、PLCγ1和ERK1/2）的磷酸化。这种协同的激酶活性促进淋巴管内皮细胞的存活、增殖、迁移和管腔形成，从而促进淋巴管的萌芽、分支和扩张。该受体-配体系统还激活MEK-ERK通路，调节细胞骨架动力学和连接组织，从而在发育和成体组织重塑过程中影响淋巴管的模式形成、瓣膜形成和液体运输能力。 VEGFR3最初表达于胚胎血管内皮细胞，妊娠中期后逐渐局限于淋巴管内皮细胞。在成人组织中，VEGFR3标记皮肤、肠道和其他器官的淋巴毛细血管和收集管，维持淋巴系统的完整性，并对炎症和组织修复信号做出反应。在病理情况下，肿瘤及其周围VEGFR3及其配体的上调会驱动淋巴管生成和扩张，促进肿瘤细胞进入并扩散至区域淋巴结。而使用中和抗体或可溶性受体构建体阻断VEGFR3信号通路，可降低肿瘤相关淋巴管密度和淋巴结转移，在某些VEGFR3参与血管生成的肿瘤模型中，阻断VEGFR3信号通路还可以降低血管密度。 VEGFR3 也表达于特殊的非淋巴区室，包括脑室下区、海马神经干细胞和心脏内皮细胞。在这些区域，VEGF-C/VEGFR3 的激活会激活 Akt 和 ERK 信号通路，从而调节神经干细胞的激活、成年神经发生以及心脏淋巴管重塑和功能的某些方面，这使得该受体在组织再生和器官稳态中发挥着超越经典淋巴生物学的更广泛作用。 |
| 参考文献 |
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