Virilizer Antibody (Rabbit mAb) [D21H17]
目录号: F8294
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: K562, Lane 2: C2C12, Lane 3: H-4-II-E, Lane 4: COS-7
操作要点
WB
建议 SDS-PAGE 分离胶浓度：5%。
湿转参考条件：250 mA, 180 min。
建议 SDS-PAGE 分离胶浓度：5%。
湿转参考条件：250 mA, 180 min。
使用信息
| 稀释比例 |
|---|
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| 抗体应用 |
|---|
| WB, IHC, IF |
| 反应性 |
|---|
| Human, Mouse, Rat, Monkey |
| 抗体类型 |
|---|
| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
|---|
| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
|---|
| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
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|---|
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210 kDa
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| 阳性对照 | K-562 cells; C2C12 cells; H-4-II-E cells; COS-7 cells; mES cells |
|---|---|
| 阴性对照 |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：250 mA, 180 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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| IF |
|---|
实验步骤：
样品准备
1. 贴壁细胞：取洁净无菌盖玻片置于培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片。
2. 悬浮细胞：将细胞接种至多聚赖氨酸包被的洁净无菌载玻片上。
3. 冰冻切片：将玻片置于室温下解冻，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。
4. 石蜡切片：先将玻片脱蜡至水，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。然后进行抗原修复。
固定
1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室温固定细胞爬片/涂片或组织切片 10~15 min。
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
通透
1. 对样品添加去垢剂，如 0.1~0.3% Triton X-100，室温通透 10~20 min。
（仅针对胞内抗原，若是细胞膜上表达的抗原则可省略该步骤。）
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
封闭
添加封闭液，在室温下封闭至少 1 h。（常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或山羊血清。）
注意事项：从封闭开始之后的所有步骤务必保证样品湿润，避免干燥，否则极易产生高背景。
免疫荧光染色（第一天）
1. 吸走封闭液，滴加稀释后的一抗。
2. 湿盒中 4°C 孵育过夜。
免疫荧光染色（第二天）
1. 吸走一抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
2. 滴加稀释后的荧光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。
3. 吸走二抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
4. 滴加稀释后的 DAPI，室温避光 孵育 5~10 min。
5. PBST 中摇洗 3 次，每次 5 分钟。
封片
1. 抗荧光淬灭封片剂封片。
2. 干燥玻片，将玻片置于室温下避光过夜。
3. 将载玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。
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| IHC |
|---|
实验步骤：
脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片：
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
| Virilizer Antibody (Rabbit mAb) [D21H17] 可检测内源性 Virilizer 总蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
|---|
| 细胞质，细胞核 |
| Uniprot ID |
|---|
| Q69YN4 |
| 克隆号 |
|---|
| D21H17 |
| 别名 |
|---|
| DKFZp434I116; DKFZp781B2117; fSAP121; functional spliceosome-associated protein 121; KIAA1429; MGC138493; MGC141940; MSTP054; virilizer homolog; VIRMA |
| 背景 |
|---|
| Virilizer (VIR)，在哺乳动物中也称为 VIRMA（VIR 样 m6A 甲基转移酶相关蛋白），是 N6-甲基腺苷 (m6A) 甲基转移酶复合物的重要调控组分。该复合物由催化亚基 METTL3 和 METTL14、衔接蛋白 WTAP 以及其他因子 HAKAI 和 ZC3H13 组成，指导位点特异性 RNA 甲基化，从而调控剪接、多聚腺苷酸化、翻译和 mRNA 稳定性。该蛋白包含一个推定的跨膜结构域、一个卷曲螺旋区以及提示其快速周转的 PEST 序列，其核定位使其能够直接参与共转录 mRNA 修饰事件。 Virilizer 蛋白将催化核心组分 METTL3/METTL14/WTAP 募集到特定的 mRNA 区域，引导 m6A 甲基化优先发生在 3' 非翻译区 (3'UTR) 和终止密码子附近，而非随机地将甲基化分布于整个转录本上。约 60% 的 VIRMA 结合的 mRNA 靶标在 3'UTR 区域表现出显著的 m6A 富集。该蛋白以 RNA 依赖的方式与多聚腺苷酸化切割因子 CPSF5 和 CPSF6 结合，从而在功能上将 m6A 沉积与选择性多聚腺苷酸化 (APA) 调控联系起来——VIRMA 或 METTL3 的缺失会导致数百个 mRNA 的 3'UTR 延长，其中超过 50% 的靶标重叠；而 CPSF5 的缺失则会导致数千个主要经过 m6A 修饰的 mRNA 的 3'UTR 缩短。 Virilizer 在果蝇性别决定中发挥着关键的发育功能，它能够促进性别致死 (Sxl) 前体 mRNA 的雌性特异性剪接。Sxl 前体 mRNA 作为主调控开关，控制着体细胞性别分化、剂量补偿和卵子发生。雌性特异性 Sxl 剪接需要性别特异性剪接内含子内的 m6A 修饰，m6A 阅读蛋白 YT521-B 负责解码这些甲基化标记，从而促进正确的剪接位点选择。Virilizer 功能丧失会导致与 Ime4（果蝇 METTL3 同源基因）突变体相似的表型，表现为雌性向雄性的性别转化和雌性特异性致死。雌激素依赖的m6A甲基化增强了Sxl的自调控剪接，其中SXL蛋白通过正反馈维持其雌性特异性表达模式。雌激素突变会破坏这种自调控，导致即使在XX动物中也产生雄性特异性的Sxl和transformer (tra)剪接变体。该蛋白在整个发育过程中发挥作用，在雄性和雌性胚胎中普遍表达，在雌性中发挥性别特异性作用，同时执行两性生存所必需的重要功能。沉积在卵中的母源雌激素产物对于XX胚胎中早期转录后Sxl调控至关重要，在合子转录启动之前建立性别特异性基因表达程序，并且对两性胚胎中一些未知的关键过程也至关重要。雌激素受体蛋白（Virilizer）参与生殖细胞性别决定过程。在未分化的生殖细胞中，早期SXL蛋白的产生不依赖于雌激素受体蛋白，但后期卵子发生过程中SXL蛋白的表达则依赖于雌激素受体蛋白。即使缺乏后期SXL蛋白，雌激素受体蛋白突变的XX生殖细胞仍能完成卵子发生。雌激素受体蛋白介导的m6A修饰主要影响性别决定靶点之外的5'非翻译区（5'UTR）的mRNA选择性剪接，并对代谢基因表达产生全局性影响。这使得雌激素受体蛋白成为一个广泛的转录后调控因子，整合了发育、代谢和性别特异性基因表达程序。酵母同源蛋白Vir1p与酵母甲基转移酶复合物的所有成员相互作用，并且对mRNA m6A甲基化和减数分裂的成功完成至关重要，这表明雌激素受体蛋白在配子发生和生殖过程中的功能具有进化保守性。特定的雄性化等位基因表现出不同的功能影响——影响大蛋白质区域的截断突变会导致两性死亡，而聚集在特定蛋白质区域内的错义突变则选择性地破坏雌性特有的功能，同时保留重要的活动。 |
| 参考文献 |
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