VPS15 Antibody (Rabbit mAb) [A22G22]
目录号: F9540
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: Raji, Lane 2: Jurkat, Lane 3: MOLT4, Lane 4: C6
操作要点
WB
建议 SDS-PAGE 分离胶浓度：5%。
建议 SDS-PAGE 分离胶浓度：5%。
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
|---|
| WB, IHC |
| 反应性 |
|---|
| Mouse, Rat, Human |
| 抗体类型 |
|---|
| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
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153 kDa
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| 阳性对照 | Human kidney tissue; Raji cells; Jurkat cells; Molt-4 cells; 293T cells; C6 cells; Raw 264.7 cells |
|---|---|
| 阴性对照 |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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| IHC |
|---|
实验步骤：
脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片：
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
| VPS15 Antibody (Rabbit mAb) [A22G22] 可检测内源性 VPS15 总蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
|---|
| 胞质囊泡，内体，内膜系统 |
| Uniprot ID |
|---|
| Q99570 |
| 克隆号 |
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| A22G22 |
| 别名 |
|---|
| VPS15 | PIK3R4 | Phosphoinositide 3-kinase regulatory subunit 4 | PI3-kinase regulatory subunit 4 | PI3-kinase p150 subunit | Phosphoinositide 3-kinase adaptor protein |
| 背景 |
|---|
| VPS15（也称为 p150）是 III 类磷脂酰肌醇 3-激酶复合物 PI3KC3-C1 和 PI3KC3-C2 的大型 HEAT 重复支架和调节亚基，它与 VPS34 和 Beclin 1 以及其他亚基（如 ATG14L 或 UVRAG/BIF-1）结合，以控制磷脂酰肌醇 3-磷酸的局部合成，从而指导自噬、内吞和胞质分裂中的膜运输事件。 VPS15 的 N 端区域包含一个推定的蛋白激酶样结构域，该结构域对于 VPS34 的激活至关重要；其后是 HEAT 重复序列和一个 C 端七叶 WD40 β 螺旋桨，该螺旋桨连接内体 PI3KC3-C2 复合物中的 VPS15-VPS34 和 VPS30/Beclin-1-UVRAG 或 VPS38 对，从而形成一个延伸的结构，将催化 VPS34 脂质激酶定位在特定的内体、自噬体或细胞分裂膜附近，并将酶活性与货物选择和复合物组装联系起来。在自噬 PI3KC3-C1 复合物中，VPS15 与 VPS34、Beclin 1 和 ATG14L 协同作用，在吞噬泡起始位点生成 PI3P，募集下游效应分子，如 WIPI 蛋白和 DFCP1，这些效应分子标记 ω 体并支持 LC3 结合和自噬体形成；在 PI3KC3-C2 复合物中，VPS15 与 VPS34、Beclin 1、UVRAG 和 BIF-1 形成亚复合物，调节降解性内吞运输和胞质分裂，高内涵显微镜显示，VPS15 或 UVRAG/BIF-1 的缺失会损害生长因子受体的降解和细胞分裂的完成，并且 UVRAG 和 BIF-1 在胞质分裂期间强烈定位于胞质中体。 VPS15 对 VPS34 的活性至关重要，包含 VPS34 和 VPS15 的保守复合物促进果蝇和哺乳动物细胞中早期自噬体的形成。VPS15 的缺失会减少 PI3P 的生成，阻断自噬体的生物合成，并阻止自噬清除蛋白聚集体，这凸显了 VPS15 在自噬 PI3P 轴中的核心作用。磷酸化蛋白质组学研究表明，VPS15 是启动自噬的 ULK 激酶复合物的直接底物：ULK 介导的 VPS15 磷酸化调节 PI3KC3-C1 的活性和自噬通量，表明 VPS15 处于上游营养感知 ULK 信号通路和下游 VPS34 依赖性膜重塑的交汇点。近期利用冷冻电镜技术对PI3KC3调控的研究进一步揭示了一条结构通路：VPS15的HEAT重复臂和WD40结构域在结合调控信号后，可将构象变化传递给VPS34和Beclin 1，从而实现对脂质激酶活性的变构调控，以响应应激、生长因子撤离或内吞信号。在哺乳动物细胞中，含有VPS15和VPS34的PI3KC3-C2亚复合物被泛素化的转铁蛋白受体募集到LC3阳性的循环内体膜上。在内体膜上，VPS15促进PI3P的合成，PI3P协调LC3的脂化以及随后ESCRT介导的吞噬泡闭合，从而将VPS15的活性直接与自噬体的形成和成熟过程联系起来。 VPS15 缺乏或突变与应激诱导和发育性自噬缺陷、受体下调受损、胞质分裂异常以及孟德尔疾病研究中的神经退行性表型有关，这与 VPS15 调节的 PI3KC3 复合物在内体分选、溶酶体降解和神经元稳态中的广泛需求相一致。 |
| 参考文献 |
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