WIP1 Antibody (Rabbit mAb) [J2N2]
目录号: F9288
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: MCF7, Lane 2: Jurkat, Lane 3: A549, Lane 4: F9
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB, IF, FCM |
| 反应性 |
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| Mouse, Rat, Human |
| 抗体类型 |
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| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
实际分子量
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67 kDa
50 kDa
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| *为什么预测分子量和实际分子量会有不同？ 以下原因可能会导致蛋白分子量与预测不同：翻译后修饰（磷酸化/糖基化）；剪接变体和异构体；相对电荷；多聚体。 |
| 阳性对照 | Human testis tissue; Human lung cancer tissue; Mouse spleen tissue; Rat spleen tissue; MCF7 cells; Jurkat cells; HCT-116 cells; A549 cells; F9 cells; RAW 264.7 cells; PC-12 cells; NIH/3T3 cells |
|---|---|
| 阴性对照 |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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| IF |
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实验步骤：
样品准备
1. 贴壁细胞：取洁净无菌盖玻片置于培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片。
2. 悬浮细胞：将细胞接种至多聚赖氨酸包被的洁净无菌载玻片上。
3. 冰冻切片：将玻片置于室温下解冻，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。
4. 石蜡切片：先将玻片脱蜡至水，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。然后进行抗原修复。
固定
1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室温固定细胞爬片/涂片或组织切片 10~15 min。
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
通透
1. 对样品添加去垢剂，如 0.1~0.3% Triton X-100，室温通透 10~20 min。
（仅针对胞内抗原，若是细胞膜上表达的抗原则可省略该步骤。）
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
封闭
添加封闭液，在室温下封闭至少 1 h。（常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或山羊血清。）
注意事项：从封闭开始之后的所有步骤务必保证样品湿润，避免干燥，否则极易产生高背景。
免疫荧光染色（第一天）
1. 吸走封闭液，滴加稀释后的一抗。
2. 湿盒中 4°C 孵育过夜。
免疫荧光染色（第二天）
1. 吸走一抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
2. 滴加稀释后的荧光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。
3. 吸走二抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
4. 滴加稀释后的 DAPI，室温避光 孵育 5~10 min。
5. PBST 中摇洗 3 次，每次 5 分钟。
封片
1. 抗荧光淬灭封片剂封片。
2. 干燥玻片，将玻片置于室温下避光过夜。
3. 将载玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。
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生物描述
| 特异性 |
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| WIP1 Antibody (Rabbit mAb) [J2N2] 可检测内源性 WIP1 总蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
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| 细胞质，细胞核 |
| Uniprot ID |
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| O15297 |
| 克隆号 |
|---|
| J2N2 |
| 别名 |
|---|
| WIP1, PPM1D, Protein phosphatase 1D, Protein phosphatase 2C isoform delta, Protein phosphatase magnesium-dependent 1 delta, p53-induced protein phosphatase 1, PP2C-delta |
| 背景 |
|---|
| PPM1D，又称野生型p53诱导磷酸酶1 (WIP1)，是一种核丝氨酸/苏氨酸磷酸酶，属于PP2C家族。在基因毒性应激后，p53可诱导其转录表达。WIP1D通过使ATM和ATR激酶的多个底物去磷酸化，发挥DNA损伤反应的稳态调节作用。该蛋白包含一个保守的PP2C催化结构域和调控区域，使其能够选择性识别关键检查点和应激信号蛋白上的磷酸化丝氨酸/苏氨酸基序，从而使WIP1能够作为一种“重置”酶，在损伤修复后终止检查点信号传导。 WIP1 直接使 p53 在 ATM/ATR 靶向的残基上去磷酸化，降低 p53 的转录活性，并形成一个负反馈环路。在该环路中，p53 诱导 PPM1D 的表达，而由此产生的磷酸酶则减弱 p53 依赖的细胞周期阻滞和凋亡，从而在 DNA 修复后恢复细胞增殖能力。该磷酸酶还能使其他几种肿瘤抑制因子和检查点组分去磷酸化并失活，包括 ATM、Chk1、Chk2、γH2AX 和 p38 MAPK。以 Chk2 为例，ATM 磷酸化 Thr68 以促进 Chk2 二聚化和激活，而 WIP1 结合 Chk2 并去除磷酸化的 Thr68，从而抑制 Chk2 的激活并抑制其对 G2/M 期 DNA 损伤检查点的贡献。通过协同去磷酸化这些底物，WIP1 降低了 DNA 损伤反应 (DDR) 信号阈值，维持细胞从 G2 期重新进入细胞周期的能力，并在应激条件下调节衰老、凋亡和自噬的决定。WIP1 本身的调控发生在多个层面：p53 驱动其转录；microRNA（例如 miR-16）在 DDR 早期限制 WIP1 的表达，以防止检查点过早终止；APC/C-Cdc20 介导的泛素-蛋白酶体降解在有丝分裂期间降低 WIP1 水平，此时 DNA 损伤大多未修复，而随后 G1 期 DDR 敏感性的增加有利于修复。当这种精细的平衡被破坏时，PPM1D 就会发挥致癌作用。该基因在多种人类癌症中扩增和过表达，包括乳腺癌和卵巢癌。在成纤维细胞转化实验中，WIP1 与经典癌基因协同作用，这与其抑制 p53、ATM、p16INK4a 和 ARF 通路以及削弱应激诱导的增殖屏障的能力相一致。在造血系统肿瘤和实体瘤中已发现 PPM1D 的功能获得性截断突变，这些突变可增强磷酸酶活性或稳定性，损害 DNA 损伤后 p53 介导的检查点，并使细胞易于发生肿瘤。而 Ppm1d 敲除小鼠则表现出对肿瘤发展的抵抗力，这支持了 WIP1 失调在癌症中起因果作用的观点。 WIP1 也在造血祖细胞、淋巴细胞和髓系细胞中表达，影响分化和免疫功能，其缺失会导致免疫缺陷和促炎表型，反映了其在应激反应、NF-κB 和 mTOR 通路调节以及组织稳态中的更广泛作用。 |
| 参考文献 |
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