YTHDF3 Antibody (Rabbit mAb) [P16G5]
目录号: F5290
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: T47D, Lane 2: HCT116, Lane 3: Neuro-2a, Lane 4: COS7
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB, IP, IF |
| 反应性 |
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| Human, Mouse, Rat, Monkey |
| 抗体类型 |
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| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
实际分子量
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70 kDa
N/A
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| *为什么预测分子量和实际分子量会有不同？ 以下原因可能会导致蛋白分子量与预测不同：翻译后修饰（磷酸化/糖基化）；剪接变体和异构体；相对电荷；多聚体。 |
| 阳性对照 | Mouse colon tissue; Mouse cerebellum tissue; Mouse hippocampus tissue; T-47D cells; HCT-116 cells; Neuro-2a cells; NIH/3T3 cells; C6 cells; COS-7 cells; 293T cells |
|---|---|
| 阴性对照 |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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| IF |
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实验步骤：
样品准备
1. 贴壁细胞：取洁净无菌盖玻片置于培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片。
2. 悬浮细胞：将细胞接种至多聚赖氨酸包被的洁净无菌载玻片上。
3. 冰冻切片：将玻片置于室温下解冻，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。
4. 石蜡切片：先将玻片脱蜡至水，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。然后进行抗原修复。
固定
1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室温固定细胞爬片/涂片或组织切片 10~15 min。
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
通透
1. 对样品添加去垢剂，如 0.1~0.3% Triton X-100，室温通透 10~20 min。
（仅针对胞内抗原，若是细胞膜上表达的抗原则可省略该步骤。）
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
封闭
添加封闭液，在室温下封闭至少 1 h。（常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或山羊血清。）
注意事项：从封闭开始之后的所有步骤务必保证样品湿润，避免干燥，否则极易产生高背景。
免疫荧光染色（第一天）
1. 吸走封闭液，滴加稀释后的一抗。
2. 湿盒中 4°C 孵育过夜。
免疫荧光染色（第二天）
1. 吸走一抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
2. 滴加稀释后的荧光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。
3. 吸走二抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
4. 滴加稀释后的 DAPI，室温避光 孵育 5~10 min。
5. PBST 中摇洗 3 次，每次 5 分钟。
封片
1. 抗荧光淬灭封片剂封片。
2. 干燥玻片，将玻片置于室温下避光过夜。
3. 将载玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
| YTHDF3 Antibody (Rabbit mAb) [P16G5] 可检测内源性 YTHDF3 总蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
|---|
| 细胞质 |
| Uniprot ID |
|---|
| Q7Z739 |
| 克隆号 |
|---|
| P16G5 |
| 别名 |
|---|
| FLJ31657; YTH domain family 3; YTH domain family protein 3; YTH domain family, member 3; YTH N6-methyladenosine RNA binding protein 3; YTHD3; YTHDF3 |
| 背景 |
|---|
| YTHDF3 属于含有 YTH 结构域的 N6-甲基腺苷识别蛋白家族，与 YTHDF1 和 YTHDF2 一起，是三个胞质旁系同源蛋白之一。这三个蛋白都具有保守的 C 端 YTH 结构域，用于识别 m6A，以及一个固有无序的 N 端区域，该区域介导蛋白质-蛋白质相互作用和亚细胞定位。YTHDF3 识别 m6A 甲基化的转录本，并通过与 40S 和 60S 核糖体亚基的组分直接相互作用，将其引导至翻译机制，从而将甲基化的 mRNA 与正在翻译的核糖体物理连接起来。这一活性与 YTHDF1 密切协同作用：这两个蛋白结合的转录本存在显著重叠，并且任何一个蛋白的缺失都会降低另一个蛋白的 RNA 结合能力，这表明靶标选择是协同的而非独立的。由YTHDF1和YTHDF3共同结合的转录本，其翻译效率显著高于仅由任一蛋白结合的转录本。YTHDF3的缺失会降低其甲基化靶标的新生蛋白产量，这表明增强翻译是其在细胞质中的主要功能。YTHDF3还表现出自调控特性，它能结合自身5'非翻译区内的m6A位点，驱动自身转录本的非依赖性翻译。这种前馈机制在适宜条件下可放大其细胞丰度。这种促进翻译的功能也延伸至病理状态。在病理状态下，YTHDF3的过表达会增强富含m6A的转录本的翻译，这些转录本编码ST6GALNAC5、GJA1、EGFR和VEGFA等基因，这些基因调控肿瘤细胞与脑内皮细胞的相互作用、血脑屏障的穿过以及血管生成。此外，YTHDF3表达升高与乳腺癌的脑转移和基因拷贝数增加相关。 YTHDF3 对 m6A 标记的核糖体相关转录本的选择性富集，以及其在正常翻译增强和疾病相关靶标结合中的双重作用，使其成为研究 m6A 依赖性翻译控制和跨组织背景下肿瘤进展的可操作节点。 |
| 参考文献 |
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