ZO-3 Antibody (Rabbit mAb) [C8F20]
目录号: F6622
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: Caco2, Lane 2: MCF7
操作要点
WB
建议 SDS-PAGE 分离胶浓度：5%。
建议一抗稀释比: 1:100000
建议 SDS-PAGE 分离胶浓度：5%。
建议一抗稀释比: 1:100000
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
|---|
| WB, IF |
| 反应性 |
|---|
| Human |
| 抗体类型 |
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| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
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101 kDa
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| 阳性对照 | Caco2 cells; MCF7 cells |
|---|---|
| 阴性对照 |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:100000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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| IF |
|---|
实验步骤：
样品准备
1. 贴壁细胞：取洁净无菌盖玻片置于培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片。
2. 悬浮细胞：将细胞接种至多聚赖氨酸包被的洁净无菌载玻片上。
3. 冰冻切片：将玻片置于室温下解冻，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。
4. 石蜡切片：先将玻片脱蜡至水，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。然后进行抗原修复。
固定
1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室温固定细胞爬片/涂片或组织切片 10~15 min。
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
通透
1. 对样品添加去垢剂，如 0.1~0.3% Triton X-100，室温通透 10~20 min。
（仅针对胞内抗原，若是细胞膜上表达的抗原则可省略该步骤。）
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
封闭
添加封闭液，在室温下封闭至少 1 h。（常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或山羊血清。）
注意事项：从封闭开始之后的所有步骤务必保证样品湿润，避免干燥，否则极易产生高背景。
免疫荧光染色（第一天）
1. 吸走封闭液，滴加稀释后的一抗。
2. 湿盒中 4°C 孵育过夜。
免疫荧光染色（第二天）
1. 吸走一抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
2. 滴加稀释后的荧光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。
3. 吸走二抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
4. 滴加稀释后的 DAPI，室温避光 孵育 5~10 min。
5. PBST 中摇洗 3 次，每次 5 分钟。
封片
1. 抗荧光淬灭封片剂封片。
2. 干燥玻片，将玻片置于室温下避光过夜。
3. 将载玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
| ZO-3 Antibody (Rabbit mAb) [C8F20] 可检测内源性 ZO-3 总蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
|---|
| 细胞连接，细胞膜，内膜系统，细胞核，细胞紧密连接 |
| Uniprot ID |
|---|
| O95049 |
| 克隆号 |
|---|
| C8F20 |
| 别名 |
|---|
| ZO3, TJP3, Tight junction protein ZO-3, Tight junction protein 3, Zona occludens protein 3, Zonula occludens protein 3 |
| 背景 |
|---|
| ZO-3 由 TJP3 编码，与两个密切相关的旁系同源物 ZO-1 和 ZO-2 一起属于膜相关鸟苷酸激酶支架蛋白家族，并具有该家族共有的结构域架构：三个串联排列的 PDZ 结构域，其后是一个 SH3 结构域和一个位于 C 端附近的鸟苷酸激酶样结构域。ZO-3 集中于上皮细胞的紧密连接处，其第一个 PDZ 结构域 PDZ1 可直接且特异性地结合 claudin 家族成员共有的保守 C 端 YV 二肽序列，这种相互作用已在体外针对 claudin 1 至 8 进行了证实；当在通常缺乏 ZO-2 和 ZO-3 但保留 ZO-1 的成纤维细胞中表达 claudin-1 或 claudin-2 时，claudin 会在细胞间边界形成网络。共转染 ZO-2 或 ZO-3 表明，它们都会与已存在的内源性 ZO-1 一起被募集到这个基于 claudin 的网络中。ZO-2 和 ZO-3 的募集依赖于两种同时发生的、结构上不同的相互作用：它们自身的 PDZ1 结构域与 claudin C 端结合，以及与已整合到网络中的内源性 ZO-1 的 PDZ2-PDZ2 相互作用。这意味着 ZO-3 在紧密连接处的组装需要 claudin 的直接结合以及与 ZO-1 的异型结合，而不仅仅是 claudin 的结合。与这种由claudin介导的募集机制一致，当将ZO-1、ZO-2和ZO-3的PDZ1和PDZ2结构域片段分别导入培养的上皮细胞后，这些片段均能独立地募集到基于claudin的紧密连接处，证实了这些特定的结构域而非全长蛋白携带了连接靶向所需的最小信息。ZO-3也能直接结合到四次跨膜紧密连接蛋白occludin的胞质尾部，但occludin缺陷的肠上皮细胞仍能正常募集ZO-1、ZO-2和ZO-3到功能性紧密连接处，这表明claudin的结合而非occludin的结合是ZO蛋白募集到连接处的主要决定因素。 ZO-3 还能结合并募集极性蛋白 PATJ 到紧密连接处，这种相互作用连接并稳定顶端和侧向紧密连接成分，将 ZO-3 的支架功能从 claudin 和 occludin 锚定扩展到更广泛的顶端-基底外侧极性维持。 |
| 参考文献 |
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