14-3-3 eta/YWHAH Antibody (Rabbit mAb) [H13P22]

目录号: F7263

抗体应用：反应性：Mouse, Rat, Human

Lane 1: Hela, Lane 2: Jurkat, Lane 3: Mouse brain, Lane 4: Rat brain

规格	价格	库存
20uL	790	现货
50uL	1240	现货
100uL	1990	现货
100uL*2	3790	现货
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操作要点

WB
湿转参考条件：200 mA, 60 min。

使用信息

稀释比例
WB1:1000 IP1:20 FCM1:100

抗体应用
WB, IP

反应性
Mouse, Rat, Human

抗体类型
Rabbit Monoclonal Antibody

储存液配方
PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件(自收到货起)
-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

预测分子量实际分子量
28 kDa 28 kDa
^*为什么预测分子量和实际分子量会有不同？以下原因可能会导致蛋白分子量与预测不同：翻译后修饰（磷酸化/糖基化）；剪接变体和异构体；相对电荷；多聚体。

阳性对照	Human fetal brain tissue; Mouse brain tissue; Mouse spleen tissue; Rat brain tissue; Rat spleen tissue; Mouse heart tissue; Mouse kidney tissue; Rat heart tissue; Rat kidney tissue; Jurkat cells; PC-12 cells; NIH/3T3 cells
阴性对照	Human brain tissue

实验方法

WB
实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 60 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 60 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

Datasheet & SDS

生物描述

特异性
14-3-3 eta/YWHAH Antibody (Rabbit mAb) [H13P22] 可检测内源性 14-3-3 eta/YWHAH 总蛋白水平。

Uniprot ID
Q04917

克隆号
H13P22

别名
YWHA1, YWHAH, 14-3-3 protein eta, Protein AS1

背景
14-3-3 η (YWHAH) 是保守的 14-3-3 衔接蛋白家族成员，可形成磷酸丝氨酸/磷酸苏氨酸依赖性二聚体，并作为可溶性支架整合多种信号通路，调控细胞存活、代谢和应激反应，尤其在神经系统中高表达，并明确参与免疫介导的病理过程。该蛋白具有典型的 14-3-3 结构，由 α 螺旋单体构成反平行二聚体，每个单体包含一个保守的两亲性沟槽，可识别 RSXpSXP 及相关磷酸肽基序；磷酸化底物与该沟槽的结合可掩盖功能位点、稳定特定构象、阻止去磷酸化或改变亚细胞定位，从而调节多种激酶、转录因子和细胞骨架调节因子的活性和周转。在神经元中，包括η亚型在内的14-3-3蛋白通过多个位点与tau蛋白直接相互作用，促进多种tau激酶对其磷酸化，并能诱导非磷酸化tau蛋白聚集，同时保护磷酸化tau蛋白免于去磷酸化。这种作用改变了微管结合和聚集体形成之间的平衡，使14-3-3蛋白成为tau蛋白寡聚化和神经原纤维缠结相关病理的积极参与者。神经元中14-3-3蛋白的高丰度使其能够与微管蛋白竞争tau蛋白结合位点，并调节野生型和突变型tau蛋白的稳态水平和聚集倾向，这表明YWHAH及其相关亚型是tau蛋白病的重要致病因素，也是tau蛋白靶向治疗策略的潜在调节因子。在免疫系统和关节微环境中，14-3-3 η 被释放到滑液和循环中，外源性 14-3-3η 可刺激巨噬细胞、单核细胞和成纤维细胞样滑膜细胞，激活 JAK–STAT、PI3K–AKT–mTOR、MAPK/ERK、JNK/AP-1 和 FOXO3–SNAI1 信号级联，并诱导 TNFα、IL-6、CCL2、基质金属蛋白酶和 RANKL 的产生，所有这些都是类风湿性关节炎中炎症、软骨退化和骨侵蚀的核心介质。在类风湿性关节炎患者中，外周血中 YWHAH mRNA 显著上调，血清 14-3-3η 水平与疾病活动指数、自身抗体滴度、缺氧标志物（如 HIF-1α）和血管生成因子（如 VEGF）密切相关；携带风险 YWHAH rs2858750 等位基因的患者表现出更高的 14-3-3η 水平、更强的炎症活性和更严重的疾病，表明该亚型将细胞内信号传导、滑膜缺氧和血管生成与临床可测量的关节损伤联系起来。

背景

14-3-3 η (YWHAH) 是保守的 14-3-3 衔接蛋白家族成员，可形成磷酸丝氨酸/磷酸苏氨酸依赖性二聚体，并作为可溶性支架整合多种信号通路，调控细胞存活、代谢和应激反应，尤其在神经系统中高表达，并明确参与免疫介导的病理过程。该蛋白具有典型的 14-3-3 结构，由 α 螺旋单体构成反平行二聚体，每个单体包含一个保守的两亲性沟槽，可识别 RSXpSXP 及相关磷酸肽基序；磷酸化底物与该沟槽的结合可掩盖功能位点、稳定特定构象、阻止去磷酸化或改变亚细胞定位，从而调节多种激酶、转录因子和细胞骨架调节因子的活性和周转。在神经元中，包括η亚型在内的14-3-3蛋白通过多个位点与tau蛋白直接相互作用，促进多种tau激酶对其磷酸化，并能诱导非磷酸化tau蛋白聚集，同时保护磷酸化tau蛋白免于去磷酸化。这种作用改变了微管结合和聚集体形成之间的平衡，使14-3-3蛋白成为tau蛋白寡聚化和神经原纤维缠结相关病理的积极参与者。神经元中14-3-3蛋白的高丰度使其能够与微管蛋白竞争tau蛋白结合位点，并调节野生型和突变型tau蛋白的稳态水平和聚集倾向，这表明YWHAH及其相关亚型是tau蛋白病的重要致病因素，也是tau蛋白靶向治疗策略的潜在调节因子。在免疫系统和关节微环境中，14-3-3 η 被释放到滑液和循环中，外源性 14-3-3η 可刺激巨噬细胞、单核细胞和成纤维细胞样滑膜细胞，激活 JAK–STAT、PI3K–AKT–mTOR、MAPK/ERK、JNK/AP-1 和 FOXO3–SNAI1 信号级联，并诱导 TNFα、IL-6、CCL2、基质金属蛋白酶和 RANKL 的产生，所有这些都是类风湿性关节炎中炎症、软骨退化和骨侵蚀的核心介质。在类风湿性关节炎患者中，外周血中 YWHAH mRNA 显著上调，血清 14-3-3η 水平与疾病活动指数、自身抗体滴度、缺氧标志物（如 HIF-1α）和血管生成因子（如 VEGF）密切相关；携带风险 YWHAH rs2858750 等位基因的患者表现出更高的 14-3-3η 水平、更强的炎症活性和更严重的疾病，表明该亚型将细胞内信号传导、滑膜缺氧和血管生成与临床可测量的关节损伤联系起来。

参考文献
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/35190930/ https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/21876254/

PVDF膜孔径规格选择参照表

Protein Size (kDa)	PVDF Transfer Membrane Pore Size (μm)
< 10	0.22
10-20	0.22
20-30	0.45
30-45	0.45
45-70	0.45
80-100	0.45
100-140	0.45
> 140	0.45

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* 必填项

Protein Size (kDa)	Separating Gel Percentage
4-40	20%
12-45	15%
10-70	12.5%
15-100	10%
25-100	8%
60-210	5%