c-Raf Antibody [K20J19]

目录号: F4668

抗体应用：反应性：Human, Mouse, Rat, Monkey, Bovine, Pig

规格	价格	库存
20uL	790	现货
50uL	1240	现货
100uL	1990	现货
100uL*2	3790	现货
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使用信息

稀释比例
WB1:1000

抗体应用
WB

反应性
Human, Mouse, Rat, Monkey, Bovine, Pig

抗体类型
Mouse Monoclonal Antibody

储存液配方
PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件(自收到货起)
-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

预测分子量
75 kDa

阳性对照	A-431 cells; HeLa cells; HT-29 cells; NIH/3T3 cells; NIE-115 cells; H-4-II-E cells; COS-7 cells; Vero cells
阴性对照

实验方法

WB
实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 120 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

Datasheet & SDS

生物描述

特异性
c-Raf Antibody [K20J19] 可检测内源性 c-Raf 总蛋白水平。

蛋白定位
细胞膜，细胞质，内膜系统，线粒体，细胞核

Uniprot ID
P04049

克隆号
K20J19

别名
RAF proto-oncogene serine/threonine-protein kinase; Proto-oncogene c-RAF (cRaf); Raf-1; RAF1; RAF

背景
c-Raf（Raf-1）与 A-Raf 和 B-Raf 一起构成 TKL 组内的丝氨酸/苏氨酸激酶 Raf 激酶家族，作为主要效应分子，被 GTP 结合的 Ras 募集以启动 MEK-ERK MAPK 通路，该通路协调包括增殖、存活、分化和迁移在内的关键细胞过程。c-Raf 具有一个 N 端调控区，其中包含 Ras 结合域 (RBD) 和一个富含半胱氨酸的 C1 结构域，用于 Ras 依赖性膜定位；一个铰链区；以及一个 C 端激酶结构域，其中包含关键的激活环磷酸化位点（Thr491、Ser494、Ser497、Ser499）以及启动位点 Ser338（由 PAK 磷酸化）和 Tyr341（由 Src 家族激酶磷酸化）。 c-Raf 的活性还受到 Ser259（Akt 调控）和 Ser621（AMPK 调控）位点上抑制性 14-3-3 结合基序的进一步调控。c-Raf 的激活由多位点磷酸化驱动，这种磷酸化诱导构象变化，从而促进高亲和力 MEK1/2 的结合和磷酸化，进而放大 ERK1/2 信号，驱动细胞周期进程（通过细胞周期蛋白 D）、抑制细胞凋亡（通过 Bad 磷酸化）、促进细胞骨架重塑，并调控 Elk-1 等转录因子。c-Raf 将生长因子和 Ras 信号整合到动态通路中，但持续的 MEK-ERK 信号会触发多个抑制位点（Ser29、Ser43、Ser289、Ser296、Ser301、Ser642）的反馈性过度磷酸化，从而降低其响应能力。 c-Raf 失调会导致 Ras 突变肿瘤（如胰腺癌和肺癌）的癌变，某些抑制剂可以反常地激活 c-Raf，并且与 B-Raf^V600E 在黑色素瘤中的组成活性相反，c-Raf 需要严格的 Ras/Src 依赖性激活，并且表现出较低的基础活性。

背景

c-Raf（Raf-1）与 A-Raf 和 B-Raf 一起构成 TKL 组内的丝氨酸/苏氨酸激酶 Raf 激酶家族，作为主要效应分子，被 GTP 结合的 Ras 募集以启动 MEK-ERK MAPK 通路，该通路协调包括增殖、存活、分化和迁移在内的关键细胞过程。c-Raf 具有一个 N 端调控区，其中包含 Ras 结合域 (RBD) 和一个富含半胱氨酸的 C1 结构域，用于 Ras 依赖性膜定位；一个铰链区；以及一个 C 端激酶结构域，其中包含关键的激活环磷酸化位点（Thr491、Ser494、Ser497、Ser499）以及启动位点 Ser338（由 PAK 磷酸化）和 Tyr341（由 Src 家族激酶磷酸化）。 c-Raf 的活性还受到 Ser259（Akt 调控）和 Ser621（AMPK 调控）位点上抑制性 14-3-3 结合基序的进一步调控。c-Raf 的激活由多位点磷酸化驱动，这种磷酸化诱导构象变化，从而促进高亲和力 MEK1/2 的结合和磷酸化，进而放大 ERK1/2 信号，驱动细胞周期进程（通过细胞周期蛋白 D）、抑制细胞凋亡（通过 Bad 磷酸化）、促进细胞骨架重塑，并调控 Elk-1 等转录因子。c-Raf 将生长因子和 Ras 信号整合到动态通路中，但持续的 MEK-ERK 信号会触发多个抑制位点（Ser29、Ser43、Ser289、Ser296、Ser301、Ser642）的反馈性过度磷酸化，从而降低其响应能力。 c-Raf 失调会导致 Ras 突变肿瘤（如胰腺癌和肺癌）的癌变，某些抑制剂可以反常地激活 c-Raf，并且与 B-Raf^V600E 在黑色素瘤中的组成活性相反，c-Raf 需要严格的 Ras/Src 依赖性激活，并且表现出较低的基础活性。

参考文献
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/28694330/ https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/29358316/

PVDF膜孔径规格选择参照表

Protein Size (kDa)	PVDF Transfer Membrane Pore Size (μm)
< 10	0.22
10-20	0.22
20-30	0.45
30-45	0.45
45-70	0.45
80-100	0.45
100-140	0.45
> 140	0.45

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* 必填项

Protein Size (kDa)	Separating Gel Percentage
4-40	20%
12-45	15%
10-70	12.5%
15-100	10%
25-100	8%
60-210	5%