CaMKIIδ Antibody (Rabbit mAb) [E8P2]
目录号: F2409
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: Hela, Lane 2: SW480, Lane 3: A431, Lane 4: Mouse heart
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB, IHC |
| 反应性 |
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| Mouse, Rat, Human |
| 抗体类型 |
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| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
实际分子量
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56 kDa
56 kDa,36 kDa
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| *为什么预测分子量和实际分子量会有不同？ 以下原因可能会导致蛋白分子量与预测不同：翻译后修饰（磷酸化/糖基化）；剪接变体和异构体；相对电荷；多聚体。 |
| 阳性对照 | Human thyroid carcinoma tissue; Human cardiac muscle tissue; Mouse heart tissue; Human skeletal muscle tissue; Rat spleen tissue; Rat heart tissue; Wild-type HAP1 cells; HeLa cells; A431 cells; SW480 cells; SiHa cells; HEK-293T cells |
|---|---|
| 阴性对照 |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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| IHC |
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实验步骤：
脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片：
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
| CaMKIIδ Antibody (Rabbit mAb) [E8P2] 可检测内源性 CaMKIIδ 总蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
|---|
| 细胞膜，内膜系统，肌浆网 |
| Uniprot ID |
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| Q13557 |
| 克隆号 |
|---|
| E8P2 |
| 别名 |
|---|
| CAMKD, CAMK2D, Calcium/calmodulin-dependent protein kinase type II subunit delta, CaM kinase II subunit delta, CaMK-II subunit delta |
| 背景 |
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| CaMKIIδ是心脏中主要的Ca²⁺/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II同工酶，它组装成多聚体全酶，并作为Ca²⁺、β-肾上腺素能和氧化还原信号的中心整合器，将重复的Ca²⁺瞬变转化为离子处理蛋白和转录调节因子的持续磷酸化，从而驱动兴奋-收缩耦联、肥大生长和心律失常的发生。该激酶包含一个N端催化结构域，其后是一个含有CaM结合元件和Thr287自磷酸化位点的自抑制区，以及一个C端结合结构域，该结构域促进寡聚化形成十二聚体和更大的聚集体；这种结构支持亚基间的自身磷酸化，并通过Thr287磷酸化、甲硫氨酸氧化和O-GlcNAc糖基化，使CaMKIIδ能够从Ca²⁺依赖性活性转变为自主活性，从而在初始Ca²⁺脉冲后仍保持活性。在心室肌细胞中，CaMKIIδ磷酸化L型Ca²⁺通道、兰尼碱受体2和磷蛋白，从而增加肌膜Ca²⁺内流，增强肌浆网Ca²⁺泄漏，并加速肌浆网再充盈。该网络的慢性过度激活会导致舒张期Ca²⁺超载、延迟后去极化和触发活动，这些都是室性心动过速和心房颤动的基础。该激酶还能磷酸化IIa类组蛋白去乙酰化酶HDAC4，导致其核输出并解除MEF2依赖性基因程序的抑制，从而将Ca²⁺和神经体液应激与压力超负荷和神经激素驱动的心脏病中的肥大基因表达、纤维化和不良重塑联系起来。在接受横向主动脉缩窄的小鼠中，CaMKIIδ基因缺失可维持心脏肥大，但显著减弱向心力衰竭的转变，减少心腔扩张、收缩功能障碍、纤维化、细胞凋亡和肌浆网Ca²⁺泄漏；而CaMKIIδ转基因过表达则导致动作电位延长、自发性后去极化、扩张型心肌病和猝死风险增加，证实该亚型是病理性心脏应激的关键转导因子。人类衰竭和缺血性心肌病样本显示 CaMKIIδ 表达和自主活性升高，下游 Ca²⁺ 处理靶点的磷酸化增加，在结构性心脏病模型中，药理学 CaMKII 抑制可改善左心室功能并抑制心律失常。 |
| 参考文献 |
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