CEBP δ/CEBPD Antibody (Rabbit mAb) [F16N9]
目录号: F7535
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: CaCO2, Lane 2: HACAT, Lane 3: 3T3-L1
操作要点
WB
湿转参考条件：200 mA, 60 min。
湿转参考条件：200 mA, 60 min。
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB, IP, IHC |
| 反应性 |
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| Mouse, Rat, Human |
| 抗体类型 |
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| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
实际分子量
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28 kDa
29 kDa
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| *为什么预测分子量和实际分子量会有不同？ 以下原因可能会导致蛋白分子量与预测不同：翻译后修饰（磷酸化/糖基化）；剪接变体和异构体；相对电荷；多聚体。 |
| 阳性对照 | Rat cerebrum tissue; Mouse hippocampus tissue; Rat hippocampus tissue; Caco-2 cells; Differentiated 3T3-L1 cells; HaCaT cells |
|---|---|
| 阴性对照 |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 60 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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| IHC |
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实验步骤：
脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片：
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
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生物描述
| 特异性 |
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| CEBP δ/CEBPD Antibody (Rabbit mAb) [F16N9] 可检测内源性 CEBP δ/CEBPD 总蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
|---|
| 细胞核 |
| Uniprot ID |
|---|
| P49716 |
| 克隆号 |
|---|
| F16N9 |
| 别名 |
|---|
| CCAAT/enhancer-binding protein delta, C/EBP delta, Nuclear factor NF-IL6-beta, NF-IL6-beta, CEBPD |
| 背景 |
|---|
| CEBPδ（CEBPD，C/EBPδ）是CCAAT/增强子结合蛋白家族中的一种碱性亮氨酸拉链转录因子，它以同源或异源二聚体的形式结合CCAAT/增强子基序，并调节与分化、炎症、应激反应和基因组稳定性相关的基因表达程序，该过程涉及多种组织。该蛋白包含一个C端bZIP结构域，介导二聚化和序列特异性DNA结合；以及一个N端转录激活区，可募集共调节因子，使CEBPD能够根据启动子环境、伴侣组成和翻译后修饰状态，发挥转录激活因子或抑制因子的作用。在慢性炎症组织中，炎症细胞因子（如TNFα和IL-1β）诱导CEBPD表达，进而激活参与细胞周期调控和染色体稳定性的下游靶基因。 TNFα驱动的CEBPD表达上调Aurora激酶C (AURKC)转录，促进着丝粒异常和非整倍体，并增强非锚定依赖性生长，表明CEBPD可通过直接调控有丝分裂调节因子将炎症信号与基因组不稳定性联系起来。在胶质瘤中，炎症因子IL-1β可提高胶质瘤干细胞样细胞中CEBPD的表达，而CEBPD可直接激活PDGFA转录，驱动球状体形成和自我更新，这支持了CEBPD作为炎症增强干性（通过PDGFA-PDGFR信号通路）的介质的作用。CEBPD还参与缺氧适应和转移：它增强HIF-1α信号传导，促进血管募集，并将缺氧炎症与肿瘤扩散整合，其在肿瘤和基质中的表达有助于建立促进肿瘤生长的微环境，增强血管生成和外渗。在肝癌中，CEBPD主要发挥抑癌基因的作用；肝细胞癌的临床分析表明，CEBPD表达下调与预后不良相关，同时CEBPD驱动特定区域的生长抑制，并调控参与细胞周期阻滞和凋亡的基因，使其成为肝细胞癌进展的调控因子，其缺失会导致疾病侵袭性增强。在小鼠胚胎成纤维细胞中，CEBPD影响DNA损伤反应和p53通路：Cebpd敲除的小鼠胚胎成纤维细胞对顺铂和甲磺酸甲酯等基因毒性药物表现出更高的耐药性，这与p53和Erk激活的改变有关；甲磺酸甲酯处理可诱导CEBPD蛋白以及磷酸化Ser15 p53和p21的表达，但不会增加p53 mRNA的表达，这表明CEBPD位于p38下游，调控p53和p21的激活，从而影响细胞凋亡和修复信号通路。 CEBPD 在许多成年组织中表达稀少，但在应激条件下可诱导表达，其多样化的功能，从生长停滞和分化到促进缺氧驱动的转移，都高度依赖于环境，反映了细胞类型、炎症环境和相互作用的转录因子对其转录输出的影响。 |
| 参考文献 |
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