Choline Acetyltransferase Antibody (Rabbit mAb) [N24K12]
目录号: F5491
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: Mouse brain, Lane 2: Rat brain
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB, IHC |
| 反应性 |
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| Mouse, Rat, Rabbit, Guinea pig |
| 抗体类型 |
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| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
实际分子量
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83 kDa
72 kDa
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| *为什么预测分子量和实际分子量会有不同？ 以下原因可能会导致蛋白分子量与预测不同：翻译后修饰（磷酸化/糖基化）；剪接变体和异构体；相对电荷；多聚体。 |
| 阳性对照 | Rat brain; Mouse cerebral cortex tissue; Mouse brain tissue; Guinea Pig brain; Guinea Pig cerebral cortex; Guinea Pig cerebellum |
|---|---|
| 阴性对照 |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:5000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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| IHC |
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实验步骤：
脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片：
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
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生物描述
| 特异性 |
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Choline Acetyltransferase Antibody (Rabbit mAb) [N24K12] 可检测内源性 Choline Acetyltransferase 总蛋白水平。 |
| Uniprot ID |
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| P28329 |
| 克隆号 |
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| N24K12 |
| 别名 |
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| Choline O-acetyltransferase, CHOACTase, ChAT, Choline acetylase, Chat |
| 背景 |
|---|
胆碱乙酰转移酶（ChAT；EC 2.3.1.6）是神经递质乙酰胆碱的生物合成酶，是中枢和周围神经系统中胆碱能神经元最特异的生化标志物。它在胞体中合成，并以可溶性和非离子膜结合形式运输到神经末梢，以支持突触处持续的递质产生。ChAT是一种单链球状蛋白，属于胆碱/肉碱酰基转移酶家族，由两个结构域组成，形成一个界面活性位点通道；结构分析结合机制研究表明，His334、Tyr95、Pro108 和 Ser550 等保守残基通过作为通用碱、稳定未质子化的组氨酸以及在四面体中间体形成过程中支持氧阴离子稳定来协调催化，从而实现乙酰辅酶A到胆碱的乙酰基可逆转移，且具有高度特异性。ChAT 基因具有独特的基因组结构，其第一个内含子编码囊泡乙酰胆碱转运蛋白 (VAChT)，由不同的启动子和剪接产生的多种 mRNA（R 型、N 型和 M 型）产生不同的转录本形式，在人类中可以生成大小不同的 ChAT 蛋白，而啮齿动物则只产生一种蛋白形式；这些结构使得 ChAT 和 VAChT 的转录调控能够协调一致，从而保证胆碱能神经元中胞质乙酰胆碱的合成和囊泡装载保持高度匹配。免疫组织化学和原位杂交定位显示，在基底前脑区域（如内侧隔核、布罗卡对角带和梅内特基底核）、纹状体结构（包括尾状核、壳核和伏隔核）、脑干核团（如脚桥核、外侧背侧被盖核和内侧缰核）以及脊髓前角运动神经元中存在 ChAT 阳性神经元，这些神经元广泛投射的轴突形成了一个广泛的胆碱能网络，参与学习、记忆、觉醒、睡眠和运动。在机制层面，ChAT催化过程包括His334对胆碱的去质子化、乙酰辅酶A羰基的亲核攻击（形成由Ser550稳定的四面体氧阴离子中间体）、该中间体的崩解（释放辅酶A并生成乙酰胆碱）。胆碱乙酰转移酶是一种可逆酰基转移酶，其动力学特性（包括对胆碱和乙酰辅酶A的底物亲和力）决定了生理和病理条件下乙酰胆碱的合成速率。改变活性位点残基、底物结合口袋或结构域界面的ChAT突变会降低催化效率或破坏酶的稳定性，导致先天性肌无力综合征，表现为发作性呼吸暂停和易疲劳性肌无力。这表明完整的ChAT结构和功能对于神经肌肉传递至关重要，并且突变在三维结构中的分布可以解释疾病的严重程度和对胆碱能疗法的反应。在神经退行性疾病中，阿尔茨海默病患者的多个皮质和海马区域的胆碱乙酰转移酶（ChAT）活性显著降低，尤其是在早发型病例中。该酶活性与痴呆严重程度和神经原纤维缠结负荷相关，而非与斑块计数相关，这支持了基底前脑胆碱能功能障碍导致认知能力下降的胆碱能假说，并为人类组织和动物模型中胆碱能通路完整性提供了一个定量标志物。肌萎缩侧索硬化症、精神分裂症和婴儿猝死综合征中也报道了ChAT异常，这些疾病中胆碱能神经支配紊乱被认为会影响临床表现。最近对灵长类特异性大ChAT亚型的研究表明，82 kDa变体的表达增加可以减轻阿尔茨海默病样小鼠模型中淀粉样蛋白病理和胆碱能功能障碍的进展，提示ChAT亚型组成和调控可能具有治疗意义。 |
| 参考文献 |
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