Flotillin 2 Antibody [A21G15]

目录号: F2390

抗体应用：反应性：Human

规格	价格	库存
20uL	790	现货
50uL	1240	现货
100uL	1990	现货
100uL*2	3790	现货
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操作要点

WB
湿转参考条件：200 mA, 60 min。

使用信息

稀释比例
WB1:1000-1:10000 IP1:40

抗体应用
WB, IP

反应性
Human

抗体类型
Rabbit Monoclonal Antibody

储存液配方
PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件(自收到货起)
-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

预测分子量实际分子量
27 kDa,47 kDa 27 kDa,47 kDa
^*为什么预测分子量和实际分子量会有不同？以下原因可能会导致蛋白分子量与预测不同：翻译后修饰（磷酸化/糖基化）；剪接变体和异构体；相对电荷；多聚体。

阳性对照	HEK293T cells; HeLa cells; A549 cells; 293 cells; A375 cells
阴性对照

实验方法

WB
实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 60 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 60 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

Datasheet & SDS

生物描述

特异性
Flotillin 2 Antibody [A21G15] 可检测内源性 Flotillin 2 总蛋白水平。

蛋白定位
细胞膜，内体，内膜系统

Uniprot ID
Q14254

克隆号
A21G15

别名
ESA1; M17S1; FLOT2; Flotillin-2; Epidermal surface antigen; Membrane component chromosome 17 surface marker 1; ESA.

背景
Flotillin-2 (FLOT2) 是 flotillin/band 7/stomatin 蛋白家族的成员，作为一种整合膜支架蛋白，它能在质膜和内体区室中自组装形成脂筏微区。其 N 端跨膜结构域和含有保守 stomatin 同源序列的中央 flotillin 结构域介导其与 flotillin-1 的异源寡聚化，从而形成稳定的、不依赖于 caveolin 的脂质平台，该平台对于组织信号转导至关重要。FLOT2（约 428 个氨基酸）具有 N 端疏水锚定区、用于寡聚化的中央 SPFH 结构域（残基约 70-140）以及用于细胞骨架偶联的 C 端带电区域，这些结构共同作用形成刚性膜曲率，从而在缺乏 caveolin 的情况下募集信号复合物。 FLOT2通过非网格蛋白依赖性途径内化EGFR、IGFR和受体酪氨酸激酶，从而调控受体的内吞和转运；通过Ras纳米簇集协调MAPK/ERK信号通路以驱动细胞增殖；通过Dishevelled募集调节Wnt/β-catenin信号通路，影响干性和分化；并通过flotillin-actin连接蛋白调控肌动蛋白重塑，从而控制伪足的形成和细胞迁移。FLOT2维持神经元和肌肉细胞膜蛋白组的稳态和极性转运；病理上，其上调通过增强信号传导和转运，驱动EGFR依赖性癌症（如非小细胞肺癌和乳腺癌）的发生；通过APP和tau蛋白的区室化与阿尔茨海默病相关；并通过胰岛素受体脱敏与代谢综合征相关。

背景

Flotillin-2 (FLOT2) 是 flotillin/band 7/stomatin 蛋白家族的成员，作为一种整合膜支架蛋白，它能在质膜和内体区室中自组装形成脂筏微区。其 N 端跨膜结构域和含有保守 stomatin 同源序列的中央 flotillin 结构域介导其与 flotillin-1 的异源寡聚化，从而形成稳定的、不依赖于 caveolin 的脂质平台，该平台对于组织信号转导至关重要。FLOT2（约 428 个氨基酸）具有 N 端疏水锚定区、用于寡聚化的中央 SPFH 结构域（残基约 70-140）以及用于细胞骨架偶联的 C 端带电区域，这些结构共同作用形成刚性膜曲率，从而在缺乏 caveolin 的情况下募集信号复合物。 FLOT2通过非网格蛋白依赖性途径内化EGFR、IGFR和受体酪氨酸激酶，从而调控受体的内吞和转运；通过Ras纳米簇集协调MAPK/ERK信号通路以驱动细胞增殖；通过Dishevelled募集调节Wnt/β-catenin信号通路，影响干性和分化；并通过flotillin-actin连接蛋白调控肌动蛋白重塑，从而控制伪足的形成和细胞迁移。FLOT2维持神经元和肌肉细胞膜蛋白组的稳态和极性转运；病理上，其上调通过增强信号传导和转运，驱动EGFR依赖性癌症（如非小细胞肺癌和乳腺癌）的发生；通过APP和tau蛋白的区室化与阿尔茨海默病相关；并通过胰岛素受体脱敏与代谢综合征相关。

参考文献
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/41663364/ https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/11159550/

PVDF膜孔径规格选择参照表

Protein Size (kDa)	PVDF Transfer Membrane Pore Size (μm)
< 10	0.22
10-20	0.22
20-30	0.45
30-45	0.45
45-70	0.45
80-100	0.45
100-140	0.45
> 140	0.45

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* 必填项

Protein Size (kDa)	Separating Gel Percentage
4-40	20%
12-45	15%
10-70	12.5%
15-100	10%
25-100	8%
60-210	5%