HGF β Antibody (Rabbit mAb) [F7L16]
目录号: F9077
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: Recombinant human HGF Protein
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB, IHC |
| 反应性 |
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| Human |
| 抗体类型 |
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| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
实际分子量
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83 kDa
35 kDa, 85 kDa
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| *为什么预测分子量和实际分子量会有不同？ 以下原因可能会导致蛋白分子量与预测不同：翻译后修饰（磷酸化/糖基化）；剪接变体和异构体；相对电荷；多聚体。 |
| 阳性对照 | Human infiltrating ductal carcinoma of the breast; Human embryonal rhabdomyosarcoma; Human uterine rhabdomyosarcoma; rhHGF cells |
|---|---|
| 阴性对照 | HeLa cells |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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| IHC |
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实验步骤：
脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片：
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
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生物描述
| 特异性 |
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| HGF β Antibody (Rabbit mAb) [F7L16] 可检测内源性 HGF β 总蛋白水平。 |
| Uniprot ID |
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| P14210 |
| 克隆号 |
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| F7L16 |
| 别名 |
|---|
| DFNB39, F-TCF, fibroblast-derived tumor cytotoxic factor, Hepatopoeitin-A, Hepatopoietin-A, HGF, HGFB, HPTA, lung fibroblast-derived mitogen, Scatter factor, scatter factor), SF |
| 背景 |
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| 肝细胞生长因子β链是异二聚体HGF配体的丝氨酸蛋白酶样亚基，HGF是一种纤溶酶原相关生长因子，它能结合并激活Met受体酪氨酸激酶，从而调节上皮细胞的增殖、迁移和形态发生。成熟的细胞因子来源于单链前体，该前体经细胞外丝氨酸蛋白酶切割成二硫键连接的α链和β链。其中，α链携带高亲和力的Met结合环状结构域和N端结构域，而β链提供一个类似于胰凝乳蛋白酶家族丝氨酸蛋白酶的蛋白酶样结构域，但缺乏催化活性，主要作为辅助的Met结合和信号转导模块发挥作用。 β链采用酶原样折叠，其“活性位点区”和“激活结构域”与胰蛋白酶样蛋白酶的催化三联体和激活环相对应。前体HGF裂解后的构象重排优化了该区域，使其能够以低亲和力与Met结合，并与受体表面的α链进行有效协同作用。HGF α链和β链与Met胞外区不同位点的结合诱导受体二聚化和胞内酪氨酸的跨自身磷酸化，进而募集衔接蛋白和效应蛋白，启动Ras-MAPK信号通路促进细胞增殖，PI3K-Akt信号通路促进细胞存活，以及其他级联反应，例如STAT和Rho家族GTP酶通路，这些通路支持细胞扩散、分支形态发生和侵袭性生长。 β链通过增强配体与Met分子（已被HGF变体占据）的结合，直接促进上述结果，维持受体磷酸化，并保持细胞铺展、运动和管状形成所需的下游信号传导。结构和突变分析表明，β链活性位点样结构域和激活结构域中的聚集残基构成功能性Met结合表面，该区域内的氨基酸替换可选择性地降低受体磷酸化和细胞迁移，而不会消除高亲和力的α链结合，这表明β链调节的是信号传导效率而非配体捕获。通过这种协同机制，HGF β链参与旁分泌信号传导，驱动肝脏再生、上皮修复和血管生成重塑；此外，当癌细胞中HGF-Met轴因配体过度产生、异常激活或受体过度表达而失调时，β链还支持侵袭性肿瘤的生长。 |
| 参考文献 |
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