MYH6+Slow Skeletal Myosin Heavy chain Antibody (Rabbit mAb) [E13G18]
目录号: F3429
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: Mouse heart , Lane 2: Rat heart
操作要点
WB
建议 SDS-PAGE 分离胶浓度：5%。
湿转参考条件：250 mA, 180 min。
建议 SDS-PAGE 分离胶浓度：5%。
湿转参考条件：250 mA, 180 min。
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB, IHC |
| 反应性 |
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| Mouse, Rat, Human |
| 抗体类型 |
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| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
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224 kDa
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| 阳性对照 | Human skeletal muscle tissue; Mouse heart tissue; Rat heart tissue |
|---|---|
| 阴性对照 | Human adult heart tissue |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：250 mA, 180 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:500），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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| IHC |
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实验步骤：
脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片：
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
| MYH6+Slow Skeletal Myosin Heavy chain Antibody (Rabbit mAb) [E13G18] 可检测内源性 MYH6+Slow Skeletal Myosin Heavy chain 总蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
|---|
| 细胞质，粗肌丝 |
| Uniprot ID |
|---|
| P13533 |
| 克隆号 |
|---|
| E13G18 |
| 别名 |
|---|
| MYHCA, MYH6, Myosin-6, Myosin heavy chain 6, MyHC-alpha, MYHCB, MYH7, Myosin-7, Myosin heavy chain 7, Myosin heavy chain slow isoform, MyHC-slow, MyHC-beta |
| 背景 |
|---|
| MYH6编码心肌α-肌球蛋白重链，这是一种肌球蛋白II家族的肌节运动蛋白，其头部结构域水解ATP并沿肌动蛋白丝产生力。慢肌肌球蛋白重链亚型具有相同的基本肌球蛋白结构，但富集于氧化性强、抗疲劳的骨骼肌纤维中，这些纤维支持持续的低速收缩。重链多肽折叠成一个N端运动结构域，其中包含ATP结合口袋和肌动蛋白相互作用界面；其后是一个颈部区域，该区域结合调节性轻链和必需轻链；以及一个由重复七肽重复序列形成的长卷曲螺旋尾部，该尾部二聚化形成粗肌丝骨架；有限的蛋白水解产生球状S1头部和S2/LMM杆状片段，反映了这些功能和结构上的亚型。在心房肌和传导组织中，α-肌球蛋白重链有助于快速的横桥循环和高效的心房收缩。MYH6基因座还包含一个内含子microRNA（miR-208a），该microRNA调控其他肌球蛋白亚型和传导相关基因的表达。因此，MYH6产物既影响心房的机械性能，也影响塑造心房电表型的基因网络。MYH6是家族性房间隔缺损的核心肌节疾病基因，也是病态窦房结综合征的强易感基因位点。α-肌球蛋白重链的罕见和常见变异会改变窦房结功能和心房传导。转换结构域中的错义变异p.Arg721Trp与病态窦房结综合征终生风险显著增加以及需要植入起搏器相关，这与转换结构域在动力冲程中将构象变化从运动结构域传递到螺旋尾部的作用相一致。其他MYH6突变，包括卷曲螺旋区域内的框内缺失（该缺失会扰乱与肌球蛋白结合蛋白C的结合），会损害心房心肌细胞的肌节组织并减慢传导。在斑马鱼中敲低myh6会降低心率，而野生型人α-肌球蛋白可以挽救这种降低，但突变型人α-肌球蛋白则不能。这表明结构完整的MYH6重链对于正常的心房兴奋-收缩耦联和窦房结输出是必需的。在心肌和慢肌中，α-肌球蛋白和慢肌肌球蛋白重链作为ATP驱动的马达，嵌入高度有序的粗肌丝中。它们的头部和转换结构域决定收缩动力学，而卷曲螺旋尾部则提供肌丝组装界面。破坏这些结构域或嵌入的调控性microRNA的MYH6变体会导致结构性心脏病、房间隔畸形和原发性传导障碍，例如病态窦房结综合征。 |
| 参考文献 |
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