Phospho-4E-BP1 (Thr37) Antibody (Rabbit mAb) [L9H8]
目录号: F2723
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: 293, Lane 2: 293 (insulin treated)
操作要点
WB
建议 SDS-PAGE 分离胶浓度：20%。
湿转参考条件：200 mA, 60 min，建议使用 0.22 μm PVDF膜。
建议 SDS-PAGE 分离胶浓度：20%。
湿转参考条件：200 mA, 60 min，建议使用 0.22 μm PVDF膜。
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
|---|
| WB |
| 反应性 |
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| Human |
| 抗体类型 |
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| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
实际分子量
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13 kDa
17 kDa
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| *为什么预测分子量和实际分子量会有不同？ 以下原因可能会导致蛋白分子量与预测不同：翻译后修饰（磷酸化/糖基化）；剪接变体和异构体；相对电荷；多聚体。 |
| 阳性对照 | 293 cells (Insulin treated) |
|---|---|
| 阴性对照 | 293 cells |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：20 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.22 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 60 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
| Phospho-4E-BP1 (Thr37) Antibody (Rabbit mAb) [L9H8] 仅识别 Thr37 处磷酸化的内源性 4E-BP1 蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
|---|
| 细胞质，细胞核 |
| Uniprot ID |
|---|
| Q13541 |
| 克隆号 |
|---|
| L9H8 |
| 别名 |
|---|
| Eukaryotic translation initiation factor 4E-binding protein 1, 4E-BP1, eIF4E-binding protein 1, Phosphorylated heat- and acid-stable protein regulated by insulin 1, PHAS-I, EIF4EBP1 |
| 背景 |
|---|
| 磷酸化4E-BP1 (Thr37) 代表了帽依赖性翻译通路中eIF4E结合蛋白1的一种早期、mTOR依赖性的调控状态，它作为一种启动修饰，整合了来自PI3K-Akt-mTOR通路的生长因子和营养信号，从而实现多位点磷酸化并调控翻译起始。低磷酸化的4E-BP1通过位于包含Thr37和Thr46的中心区域附近的典型YXXXXLΦ基序与mRNA帽结合蛋白eIF4E紧密结合，阻碍eIF4G的对接，并阻止eIF4F复合物的组装。eIF4F复合物负责将40S核糖体亚基募集到5′帽上。同时，N端和C端区域稳定了这种抑制构象，并响应上游激酶的输入。当 4E-BP1 与 eIF4E 形成复合物时，FRAP/mTOR 直接在 Thr37 和 Thr46 位点磷酸化 4E-BP1，生成与体内两个最显著的 4E-BP1 磷酸肽共迁移的磷酸肽，并将 Thr37 和 Thr46 鉴定为 mTOR 的主要靶位点；即使在血清饥饿的细胞中，这些残基也高度磷酸化，并且存在于所有电泳不同的磷酸化 4E-BP1 亚型中，包括与 eIF4E 结合的形式。 Thr37 和 Thr46 的磷酸化不会破坏 4E-BP1-eIF4E 复合物或改变电泳迁移率，但突变分析表明，Thr37/Thr46 的磷酸化对于 C 端半段下游“血清敏感”位点（Thr70 和 Ser65）的有效后续磷酸化是必需的，因为 Thr37Ala、Thr46Ala 或双 Thr37Ala/Thr46Ala 取代会使 4E-BP1 的总磷酸掺入量减少 10-20 倍，并消除 C 端磷酸肽的出现，而不会损害基础 eIF4E 结合，这定义了磷酸化 Thr37/Thr46 是 eIF4E 分级磷酸化和释放的必要启动事件。在饥饿条件下，Thr37 和 Thr46 的磷酸化对雷帕霉素和 LY294002 敏感，并由 PI3K-Akt-mTOR 轴驱动：PI3K 或 Akt 抑制，或雷帕霉素敏感的 mTOR 阻断，均可降低 Thr37/Thr46 的磷酸化水平；而组成型活性 Akt 则促进血清刺激期间靶向的相同位点的磷酸化，这使得 Thr37 磷酸化的 4E-BP1 成为 Akt 下游 mTORC1 输出的近端报告分子。在果蝇中，同源物 d4E-BP 表现出 Thr37 和 Thr46 之间保守的调控相互作用，其中胰岛素刺激的 Thr46 磷酸化（可通过磷酸化 Thr37/46 抗体检测）是将 d4E-BP 从 eIF4E 结合的翻译抑制因子转化为结合力较弱形式的主要事件；这种调控依赖于胰岛素-PI3K-Akt-TSC-TOR信号通路，因为针对Dp110（PI3K）、dAkt、dTSC1或dTOR的RNAi分别会降低或增加d4E-BP Thr37/Thr46的磷酸化水平，并以符合线性Akt→TSC→TOR→4E-BP通路的方式改变d4E-BP的亚型模式。果蝇的层级分析表明，在血清饥饿的细胞中，d4E-BP在不阻止eIF4E相互作用的位点上携带多个磷酸基团。胰岛素以雷帕霉素敏感的方式触发Thr46位点的额外磷酸化，这与酸性更强的亚型的出现和eIF4E结合的减少相一致。这在功能上反映了哺乳动物4E-BP1中Thr37/Thr46磷酸化启动的必要性，该磷酸化启动后续修饰，从而释放eIF4E并允许eIF4F组装。这些发现表明，磷酸化 4E-BP1 (Thr37) 处于一个两步机制中，其中 mTORC1 首先磷酸化 eIF4E 结合的 4E-BP1 上的 Thr37/Thr46，以产生启动中间体，然后其他激酶——仍然在 mTORC1 信号传导环境中运行——修饰 Thr70 和 Ser65，最终导致 eIF4E 结合的丧失，从抑制性翻译状态转变为允许性翻译状态，以及生长和存活相关蛋白的合成增加。 |
| 参考文献 |
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