Phospho-ABL1 (Tyr245) Antibody (Rabbit mAb) [F15J16]
目录号: F0807
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: BV-173
操作要点
WB
建议 SDS-PAGE 分离胶浓度：5%。
建议 SDS-PAGE 分离胶浓度：5%。
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB |
| 反应性 |
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| Human |
| 抗体类型 |
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| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
实际分子量
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123 kDa
135 kDa (c-Abl); 210 kDa (Bcr-Abl)
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| *为什么预测分子量和实际分子量会有不同？ 以下原因可能会导致蛋白分子量与预测不同：翻译后修饰（磷酸化/糖基化）；剪接变体和异构体；相对电荷；多聚体。 |
| 阳性对照 | CML-T1 cells; BV173 cells |
|---|---|
| 阴性对照 |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
| Phospho-ABL1 (Tyr245) Antibody (Rabbit mAb) [F15J16] 仅识别 Tyr245 处磷酸化的内源性 ABL1 蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
|---|
| 细胞质，细胞骨架，内膜系统，线粒体，细胞核 |
| Uniprot ID |
|---|
| P00519 |
| 克隆号 |
|---|
| F15J16 |
| 别名 |
|---|
| Tyrosine-protein kinase ABL1, Abelson murine leukemia viral oncogene homolog 1, Abelson tyrosine-protein kinase 1, Proto-oncogene c-Abl, p150, ABL1, ABL, JTK7 |
| 背景 |
|---|
| c-Abl蛋白Tyr245位点的磷酸化是其激活的关键标志。c-Abl是一种非受体酪氨酸激酶，属于Abl家族的多功能信号蛋白，能够调控细胞对DNA损伤、氧化应激、生长因子、黏附信号以及细胞核和细胞质中细胞骨架动力学的反应。c-Abl包含一个N端帽状结构域、SH3和SH2调控结构域、一个含有Tyr245的连接区、一个催化激酶结构域以及一个含有Tyr412的激活环。在基础条件下，这些结构域共同维持激酶的自身抑制构象。SH2-激酶连接区内Tyr245位点的磷酸化会破坏抑制性的分子内相互作用，使SH2结构域远离催化裂隙，从而增强激酶活性，并促进Tyr412位点的后续自身磷酸化，最终稳定完全激活的构象。活化的磷酸化c-Abl可磷酸化多个下游底物，包括c-Jun（增强AP-1依赖性转录）、CrkL（调节Rac/Cdc42介导的细胞骨架重塑）以及Abi1（控制WAVE复合物的组装和细胞迁移过程中伪足的形成）。在DNA损伤信号通路中，活化的c-Abl与ATM相互作用，促进p73等促凋亡因子的磷酸化，进而诱导Puma等凋亡基因的表达。而在PDGF等生长因子刺激下，c-Abl与Nck和PI3K等衔接蛋白协同作用，激活参与细胞增殖和存活的MAPK/ERK通路。Tyr245磷酸化在神经元发育中至关重要，尤其是在EphB受体介导的生长锥塌陷和轴突导向中，并且还通过磷酸化Sam68等RNA结合蛋白参与应激颗粒的调控。 Tyr245位点的磷酸化诱导构象转变，从而解除ATP结合口袋和激活环的空间位阻，使底物能够有效结合并激活激酶信号通路。Tyr245位点磷酸化失调或持续存在是白血病中致癌性BCR-ABL融合蛋白的标志性特征，其中c-Abl的持续激活驱动Ras、STAT5和PI3K信号通路，促进细胞不受控制的增殖和髓系转化。 |
| 参考文献 |
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